胚胎的發育是一複雜並具系統性調控的有絲分裂過程，由一連串基因的開啟與關閉調控細胞分裂（cell proliferation）、細胞移動（cell movement）與細胞分化（cell differentiation），進而達成質與量的擴增，同時定義出極性（polarity）和建立體軸（body axis patterning）（圖一）。由受精卵發育為成熟的多細胞個體的階段可大致區分為三里程碑：原腸化（gastrulation）、神經生成（neurulation）與器官形成（organogenesis） ，最終分化成具有功能的生物構造、生長為成熟個體 [1]。
圖一、胚胎發育流程。
受精卵經過多次卵裂形成桑葚胚（morula）後，發展至囊胚（blastocyst）著床於子宮內膜，經過原腸化（gastrulation）與器官形成（organogenesis），最終分化成具有功能的生物構造。具體流程則包括細胞質量與體積的擴增，並參與多種分子訊息的調控。
圖片來源：Kojima, Y., Tam, O. H., & Tam, P. P. (2014). Timing of developmental events in the early mouse embryo. In Seminars in cell & developmental biology (Vol. 34, pp. 65-75). Academic Press.
為觀察並研究發育過程中的重要關鍵，研究團隊使用先前發展的誘導 ETX（induced ETX, iETX）胚胎進行分析 [2] [3]。此 iETX 人工合成胚胎是由胚胎幹細胞（embryonic stem cells, ESCs）、滋胚層幹細胞（trophoblast stem cells, TSCs）以及瞬時表達 Gata4 基因的內胚層幹細胞（extraembryonic endoderm stem cells, XEN）所組成──稱之為 ETiX 胚狀體（ETiX-embryoid），相比於過往的人工合成胚胎具備更高的發育潛力（圖二）。
圖二、人工合成 ETiX 胚狀體（ETiX-embryoid）形成示意圖。
圖中胚胎發育時期以 E（embryonic days，即受精後天數，亦作 days post coitum / d.p.c.） 表示。三種胚胎幹細胞進行培養後，於第 4 天 ETiX 胚狀體能進而產生類似於著床後自然胚胎 E5.5 的結構；隨後於第 5 天發展到原腸胚形成（相當於自然胚胎 E6.5）；第 7 天可觀察其發生神經生成（相當於自然胚胎 E8.0）；於第 8 天發展至器官發生（相當於自然胚胎 E8.5）。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-022-05246-3
令人興奮的是，此人工合成的 ETiX 胚狀體無須額外給予外部信號，在特定培養條件下能夠發育至器官形成階段，即相當於自然小鼠胚胎至受精後 8.5 天的發育程度。過程中可觀察包含體節生成（somitogenesis）、腸管發育（gut development）、神經管生成、具備中腦（forebrain）與前腦（midbrain）區域的大腦，以及搏動的心臟組織（圖三）；其中，神經管兩側具備已發育的神經褶（neural fold），並在尾部形成原胚生殖細胞（primordial germ cells, PGC）；另一方面，此 ETiX 胚狀體也發展出羊膜（amnion）和卵黃囊（yolk sac）的膜內發育構造，呈現出與自然狀態下生長之胚胎生長相似的結構與型態，為胚胎提供營養。
圖三、自然胚胎與合成 ETiX 胚狀體之結構比較。
圖組（a）顯示明視野觀察下自然胚胎與 ETiX 胚狀體具有相似的型態。利用中腦及前腦之標記信號 OTX2 及 FOXG1 來界定大腦區域，在圖組（b）可見 ETiX 胚狀體與自然胚胎呈現出相似的表現模式。轉錄因子 MYH2 和 GATA4 可作為心臟組織發育之標記信號，於圖組（c）顯示 ETiX 胚狀體具備心臟組織生成。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-022-05246-3
人工合成 ETiX 胚狀體的技術突破除了證明胚胎幹細胞與胚外幹細胞的結合具有組織能力外，同時揭露其具備作為胚胎發育生理學的研究模型之前景。本篇研究更針對 PAX6 這個調控胚胎神經管生成、大腦和眼睛發育所需的轉錄因子進行基因剔除 [4]，以測試 ETiX 胚狀體的發育機制是否與天然胚胎的神經管相同。實驗結果顯示此模型能夠重現於自然小鼠胚胎中觀察到的 Pax6 基因剔除結果，不僅證明 ETiX 胚狀體與天然胚胎具備相同的發育機制，更顯示此模型能針對基因層次進行操作與分析（圖四）。
圖四、能在合成 ETiX 胚狀體中成功進行 Pax6 基因剔除，產生與自然小鼠胚胎相似的結果。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-022-05246-3
儘管 ETiX 胚狀體的結構與分子層次表現非常接近自然胚胎，此模型仍無法全然模擬發育的所有階段，例如：無法完全重現神經胚（neurula）的形成過程及後續腦部與脊髓的分化；另一方面，胚外的細胞譜系（extraembryonic lineages）與自然胚胎也有所分歧，可能是由於胚狀體缺乏與母體環境接觸所導致的。
無論如何，本研究結果仍舊為人工合成胚胎領域捎來希望與期盼，除了技術上的更進一步發展，倫理道德上的議題也值得我們關注。受精後 8.5 天的鼠胚相當於人類胚胎發育的第 17 至第 19 天（註：人類胚胎發育研究規範侷限於 14 天前）。倘若未來有機會應用於人類胚胎發育時，是否應先釐清該時期的人工合成胚胎具備神經或腦部活動或具備意識？又或者我們又要回歸原本，定義何為生命？在合成胚胎技術成熟前，對於體外培養人類胚胎的倫理約束與規範應如何界定，仍待審慎思量。
Investigator 選文｜Mouse embryo models built from stem cells take shape in a dish
Investigator 選文｜Post-gastrulation synthetic embryos generated ex utero from mouse naive ESCs: Cell
Main article:
Amadei, G., Handford, C. E., Qiu, C., De Jonghe, J., Greenfeld, H., Tran, M., Martin, B. K., Chen, D., Aguilera-Castrejon, A., Hanna, J. H., Elowitz, M. B., Hollfelder, F., Shendure, J., Glover, D. M., & Zernicka-Goetz, M. (2022). Embryo model completes gastrulation to neurulation and organogenesis. Nature, 610(7930), 143-153. https://doi.org/10.1038/s41586-022-05246-3
參考文獻：
[1] Kojima, Y., Tam, O. H., & Tam, P. P. (2014). Timing of developmental events in the early mouse embryo. In Seminars in cell & developmental biology (Vol. 34, pp. 65-75). Academic Press. https://doi/10.1016/j.semcdb.2014.06.010
[2] Sozen, B., Amadei, G., Cox, A., Wang, R., Na, E., Czukiewska, S., Chappell, L., Voet, T., Michel, G., Jing, N., Glover, D. M., & Zernicka-Goetz, M. (2018). Self-assembly of embryonic and two extra-embryonic stem cell types into gastrulating embryo-like structures. Nature Cell Biology, 20(8), 979-989. https://doi.org/10.1038/s41556-018-0147-7
[3] Amadei, G., Lau, K., De Jonghe, J., Gantner, C. W., Sozen, B., Chan, C., Zhu, M., Kyprianou, C., Hollfelder, F., & Zernicka-Goetz, M. (2021). Inducible Stem-Cell-Derived Embryos Capture Mouse Morphogenetic Events In Vitro. Developmental cell, 56(3), 366–382.e9. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.12.004
[4] Osumi, N., Shinohara, H., Numayama-Tsuruta, K., & Maekawa, M. (2008). Concise review: Pax6 transcription factor contributes to both embryonic and adult neurogenesis as a multifunctional regulator. Stem cells (Dayton, Ohio), 26(7), 1663–1672. https://doi.org/10.1634/stemcells.2007-0884
關鍵字：Embryo in vitro model、gastrulation、neurulation、organogenesis、ETiX-embryoid
撰文｜陳祈瀅
審稿｜陳品萱、黃云宣
