大腦的專屬新訓中心––頭骨骨髓供給腦膜中的髓系細胞

中樞神經系統 （central nervous system）掌管了動物的認知與反應，它複雜與脆弱的結構需要身體格外的保護。其中最著名的保護之一就是血腦屏障 （blood brain barrier, BBB），有別於身體其他器官透過循環系統與淋巴系統運輸免疫細胞，大腦區域與身體的免疫循環卻是獨立的。血腦屏障會阻擋免疫細胞或是各種蛋白質如抗體由血液循環進入大腦區域，使大腦的免疫系統與身體其他部分分開。舉例來說，身體各部位中的組織常駐巨噬細胞 （tissue-resident macrophage） 在汰換的過程中會由循環系統中的單核球 （monocyte） 分化填補空位。然而，大腦中的組織常駐巨噬細—微膠細胞（microglia）卻從胚胎時期便存在，且汰換過程僅仰賴初始的細胞一代傳一代的細胞分裂填補空缺，由此可見大腦免疫系統的獨立性。

大腦外側的結構由內而外依序是腦實質（parenchyma）、軟腦膜 （pia mater）、蛛網膜 （arachnoid）、硬腦膜（dura mater）、頭骨、骨膜 （periosteum）與頭皮 [註1]，在蛛網膜下腔有腦脊髓液 （cerebrospinal fluid, CSF）流動，負責供給大腦養分、移除廢物與給予緩衝。

即便一直以來血腦屏障被認為隔開大腦與身體的免疫系統，近期的研究發現不僅腦脊髓液中含有複雜的免疫細胞組成，在 CNS 的邊界，如如腦膜也含有單核球、嗜中性球（neutrophil）和巨噬細胞 （macrophage）等髓系細胞（myeloid cell）。2021 年由來自聖路易華盛頓大學的 Dr. Jonathan Kipnis 團隊 [1] 於 Cell 發表的研究顯示大腦會將內部的抗原傳送至大腦外層的硬腦膜靜脈竇中，透過抗原呈現細胞將大腦中的抗原呈現給循環系統中的 T 細胞。

同一團隊同年於 Science [2] 中發表腦膜的髓系細胞（myeloid cell） ，包括巨噬細胞及嗜中性球，並不源自於循環系統，而是透過頭骨與脊髓骨髓的造血幹細胞（hematopoietic stem cell） 分化補充。為了研究 CNS邊界的髓系細胞來源，研究團隊首先檢驗頭骨與脊髓之硬（腦）膜，以及二者骨髓的單核球與嗜中性球是否源自循環系統。實驗使用駢體生物系統 （parabiosis）將野生型小鼠與帶有綠色螢光蛋白（green fluorescence protein;GFP）之小鼠縫合，使兩隻老鼠共享同一套循環系統（圖一），兩個月後觀察野生型小鼠的血液、CNS邊界組織，以及周邊組織，如脾臟及肝臟中髓系細胞與淋巴細胞 （lymphoid cell） 表現螢光的比例。結果發現上述組織中均含有接近血液中 40% 的螢光 CD4 T 細胞，表示淋巴細胞源自血液循環；然而髓系細胞的部份，在頭骨與脊髓之硬(腦)膜及骨髓中測得的嗜中性球與單核球僅能發現約 10% 的螢光細胞，螢光比例明顯低於該細胞分布於血液與周邊組織的含量，表示 CNS 邊界組織的髓系細胞可能不通過血液循環補充來源（圖二A-C）。透過標記所有的髓系細胞以確認硬腦膜的髓系細胞半衰期，結果指出單核球與嗜中性球在硬腦膜與在血液的半衰期相仿，因此可排除因細胞汰換，導致硬腦膜測得低比例螢光細胞之可能性（圖二D-E）。進一步標定血液、頭骨骨髓與硬腦膜的新生髓系細胞與正在進行細胞分裂的髓系細胞，發現硬腦膜與頭骨骨髓的嗜中性球展現相近的新生細胞比例，但血液中卻幾乎測不到新生的嗜中性球，且僅頭骨骨髓測得較高比例的細胞生長及分裂標誌，硬腦膜的細胞分裂標誌則表現低落（圖二F-I），實驗結果暗示分布於硬腦膜的髓系細胞可能源自快速增生的頭骨與脊髓骨髓，而非源自血液，且細胞在骨髓外的地方進行細胞分裂的能力較差。

圖二、A-C：兩隻小鼠的循環系統流通後可以發現頭骨及脊髓之硬(腦)膜與二者骨髓中的單核球與嗜中性球表現螢光標記的比例低於周邊組織；D-E：以 ZsGreen 標記所有的髓系細胞，發現硬腦膜、頭骨骨髓與周邊組織的髓系細胞半衰期相仿；F-I：以胸腺嘧啶類似物EdU插入情形及細胞生長及分裂標誌 Ki67 分析血液、頭骨骨髓與硬腦膜的細胞增生與細胞分裂情形，結果發現頭骨骨髓與硬腦膜之增生的單核球與嗜中性球比例相似，血液中則幾乎測不到增生的嗜中性球；相較血液與硬腦膜，頭骨骨髓可測得較高比例的單核球與嗜中性球表現 Ki67，表示分布於頭骨骨髓的細胞有較高比例的處於細胞生長或分裂期。
圖片來源: https://doi.org/10.1126/science.abf7844

為了探究腦膜中的髓系細胞是否源自頭骨，研究團隊將綠色螢光小鼠的頭骨移植到野生型小鼠上（圖三）。結果顯示，頭骨移植三十天後的硬腦膜中可以觀察到單核球有 15.9% 帶有綠色螢光，嗜中性球則有 18.7% 表現。研究團隊為了證明連體共生及頭骨移植實驗並非手術造成的發炎結果而進行輻射實驗，將小鼠的頭部或身體分別以鉛板遮蓋保護，並照射輻射線後可以殺死未被遮蓋部分的骨髓幹細胞。骨髓移除後再進行帶有綠螢光基因的骨髓移植，觀察身體各處免疫細胞綠螢光的表現狀況。實驗結果表示遮蓋頭部時，頭骨骨髓的細胞受到保護，此時可觀察到循環系統的免疫細胞會逐漸被帶有綠螢光基因的細胞替換，但硬腦膜與頭骨骨髓的單核球與嗜中性球的螢光細胞比例依然低於周邊組織，此結果與駢體生物實驗所觀察到的結果一致；然而，相對將身體覆蓋時，硬腦膜中的單核球將會增加帶有綠螢光的細胞。由此推論硬腦膜中的單核球與嗜中性球主要由頭骨中的骨髓補充（圖四）。在疾病的模式中，研究團隊發現當腦部處於受損或強烈發炎時，將會有頭骨骨髓來源的巨噬細胞浸潤，然而 T 細胞、嗜中性球卻大多來自循環系統。

總結來說，這次的研究首次發現大腦腦脊髓液中的單核球由頭骨骨髓提供，同年亦有研究深入探討腦脊髓液中的 B 細胞與腦神經疾病的關係 [3]。在今年的短篇文章中，Dr. Jonathan Kipnis 的研究團隊 [4] 更發表有關頭骨將免疫細胞傳送至腦膜甚至是大腦區域的方式。同樣在今年，該研究團隊亦發表了有關腦脊髓液中的巨噬細胞協助調控腦脊髓液流動的文章 [5]。這些研究為大腦中的免疫系統開啟全新的研究方向，所有腦部發炎的研究都有機會獲得突破，如多發性硬化症、阿茲海默症、帕金森氏症與亨丁頓氏舞蹈症等。了解這些免疫細胞的來源更有助於我們了解甚至改善疾病造成的損害。

參考文獻：

1. Rustenhoven, J., Drieu, A., Mamuladze, T., de Lima, K. A., Dykstra, T., Wall, M., Papadopoulos, Z., Kanamori, M., Salvador, A. F., Baker, W., Lemieux, M., Da Mesquita, S., Cugurra, A., Fitzpatrick, J., Sviben, S., Kossina, R., Bayguinov, P., Townsend, R. R., Zhang, Q., Erdmann-Gilmore, P., … Kipnis, J. (2021). Functional characterization of the dural sinuses as a neuroimmune interface. Cell, 184(4), 1000–1016.e27. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.040
2. Cugurra, A., Mamuladze, T., Rustenhoven, J., Dykstra, T., Beroshvili, G., Greenberg, Z. J., Baker, W., Papadopoulos, Z., Drieu, A., Blackburn, S., Kanamori, M., Brioschi, S., Herz, J., Schuettpelz, L. G., Colonna, M., Smirnov, I., & Kipnis, J. (2021). Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs for the meninges and CNS parenchyma. Science, 373(6553), eabf7844. https://doi.org/10.1126/science.abf7844
3. Brioschi, S., Wang, W. L., Peng, V., Wang, M., Shchukina, I., Greenberg, Z. J., Bando, J. K., Jaeger, N., Czepielewski, R. S., Swain, A., Mogilenko, D. A., Beatty, W. L., Bayguinov, P., Fitzpatrick, J. A. J., Schuettpelz, L. G., Fronick, C. C., Smirnov, I., Kipnis, J., Shapiro, V. S., Wu, G. F., … Colonna, M. (2021). Heterogeneity of meningeal B cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders. Science, 373(6553), eabf9277.https://www.science.org/doi/10.1126/science.abf9277
4. Mazzitelli, J. A., Smyth, L. C. D., Cross, K. A., Dykstra, T., Sun, J., Du, S., Mamuladze, T., Smirnov, I., Rustenhoven, J., & Kipnis, J. (2022). Cerebrospinal fluid regulates skull bone marrow niches via direct access through dural channels. Nature neuroscience, 25(5), 555–560. https://doi.org/10.1038/s41593-022-01029-1
5. Drieu, A., Du, S., Storck, S. E., Rustenhoven, J., Papadopoulos, Z., Dykstra, T., Zhong, F., Kim, K., Blackburn, S., Mamuladze, T., Harari, O., Karch, C. M., Bateman, R. J., Perrin, R., Farlow, M., Chhatwal, J., Dominantly Inherited Alzheimer Network, Hu, S., Randolph, G. J., Smirnov, I., … Kipnis, J. (2022). Parenchymal border macrophages regulate the flow dynamics of the cerebrospinal fluid. Nature, 611(7936), 585–593. https://doi.org/10.1038/s41586-022-05397-3

撰文｜蔡宗霖
審稿｜劉姿婷