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突觸內的大千世界:視覺化囊泡運輸相關蛋白的分佈及含量

突觸的囊泡循環(vesicle recycling)對於研究細胞內物質運輸(cellular trafficking)機制來說是個經典的模型。在突觸中,參與鈣離子調控的囊泡胞吐作用之關鍵蛋白,如 SNAREs, synaptotagmins, complexins,其結構與功能的研究已經累積豐富並具有生物意義的知識。即便該議題在過去幾年非常熱門,但視角仍都處於微觀面,在生物體裏分子作用效率的執行面,像是這些關鍵蛋白在突觸中是以何種形式分佈?以及其數量的比例多寡,如何使得突觸中囊泡的分泌得以維持高效能,尚未有著直觀的數據及模型支持。2014 年五月,由哥廷根大學醫學中心 Rizzoli Silvior 教授所領導的團隊結合了定量免疫染色法(quantitative immunoblotting)以及質譜儀定出特定蛋白在突觸中的含量,搭配先進的超高解析顯微法(super resolution fluorescence microscopy)找出特定蛋白在突觸中的分佈形式,最後,根據這些數據建立了內含三十萬個蛋白質的三維突觸模型(圖A)。

[具有細緻調控的突觸囊泡循環]

突觸內囊泡的循環裡,游離在突觸的囊泡利用 SNARE(soluble NSF(N-ethylmaleimide-sensitive factor)Attachment protein Receptor)相關蛋白黏附(docking)到活化區(Active Zone)後,待鈣離子通道產生鈣離子的淨通量(influx)後,位於釋放裝置上(release appartus)的鈣離子偵測蛋白會立即感應,並促成融合作用(fusion)釋放神經傳導物質(exocytosis)。另一方面,胞飲作用(endocytosis)會藉由具有 SH3 domain 的蛋白引導,例如 Amphiphysin 將  Dynamin 帶到胞飲區掐入形成新的囊泡(圖B)。簡而言之,完成一個囊泡循環需要許多蛋白質的通力合作(參考資料1, 2)。

[單一突觸體內平均特定運輸蛋白的總量及分布]

團隊將取自鼠腦的均質液(homogenate)離心取突觸體(synaptosome)層,利用定量免疫染色,計算出得到每公克突觸體裡面特定蛋白的重量。同時染突觸體外膜,利用螢光顯微鏡計算每公克突觸體的數量。兩者相除便會得到特定蛋白在一個突觸體中“平均”個數(copy number)。但特定蛋白究竟在突觸裡面是以何種形式分佈呢?多虧有了突破繞射極限的超高解析顯微法(注一),團隊利用受激放射顯微法 STED(STimulated Emission Depletion),將六十二種蛋白分別進行免疫染色,發現某些蛋白分佈採用的是人海戰術,例如 amphiphysin 四散在整個突觸中。另外某些蛋白則是具有區域專一性,例如 Rab3,與突觸囊泡的分佈呈正相關,或像是 SNARE 相關蛋白 syntaxin 1,其分佈趨勢集中於突觸的活化區(圖C)。最後團隊結合了定量及蛋白分佈區的數據,利用已知的蛋白結構,模擬出分子層級的單一突觸的模型(圖A)。

對於身攬神經元間彼此溝通重任的突觸來說,此篇研究細緻地以分子層級,為人們呈現了蛋白在“平均”突觸中趨於真實分佈的樣貌。在許多苦工的巨量投資以及最先進的技術堆砌下,此篇研究成果揭示了單一蛋白在神經元內部的運轉情況,並提供給科學家們絕佳的詮釋素材。

 

注一:2014年獲得諾貝爾化學獎之技術:超高解析顯微法,有兩種方式,第一種是利用抑制光來獲得超越繞射極限的解析度,即受激放射顯微法。第二種為分開激發在繞射限制範圍內的螢光標記,即光啟動定位顯微法(參考資料 3)。圖片來源:https://tinyurl.com/ybcnrtuv、https://tinyurl.com/y7m2udh8

參考資料:

  1. Haucke, V., Neher, E., & Sigrist, S. J. (2011). Protein scaffolds in the coupling of synaptic exocytosis and endocytosis. Nature Reviews Neuroscience, 12(3), 127-138. doi:10.1038/nrn2948
  2. Jahn, R., & Fasshauer, D. (2012). Molecular machines governing exocytosis of synaptic vesicles. Nature, 490(7419), 201-207. doi:10.1038/nature11320
  3. 【2014諾貝爾化學獎深入報導】 打破光學顯微鏡的解析度極限-超高解析螢光顯微法 | 科學Online. (n.d.). Retrieved from http://highscope.ch.ntu.edu.tw/wordpress/?p=58742

撰稿|邱亮源

修訂|林映希

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邱亮源

凱斯西儲大學化學所博士班三年級。研究興趣是結構生物學及生物物理。希望透過investigator平台,能夠擴展視野,與來自不同生醫領域的朋友交流,並藉由撰寫科普文章,為推廣生醫研究盡一份心力。