麵包酵母也能生產第一線抗生素青黴素了！

自從 1928 年，英國科學家弗來明偶然地發現人類歷史上第一種抗生素——青黴素之後，抗生素就一直是人類對抗細菌的一大利器。在約九十年後的今天，一群英國的科學家成功地利用合成生物學和長片段 DNA 定序技術，使麵包酵母外泌生產青黴素，更進一步提升產量，使得直接利用麵包酵母培養液即可有效地抑制化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的生長。

由於合成生物學的蓬勃發展，利用單細胞麵包酵母表現來自原核或真核生物的多種酵素，以生產藥用化合物已有許多成功案例。其中，一大類藉由細菌和真菌的非核醣體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase, NRPS）所合成的藥用化合物，稱為非核醣體肽（non-ribosomal peptides, Nrp），例如由真菌 Penicillium chrysogenum（產黃青黴菌）生產的青黴素、著名後線廣效的萬古黴素（vancomycin）。想要利用麵包酵母生產青黴素，除了轉入 pcbAB（NRPS 基因）、npgA（pcbAB的活化子）外，還必須轉入能將 Nrp 轉換成具有活性之青黴素所需的相關酵素，包含基因 pcbC、pclA、penDE（圖一）。先前研究將 pcbAB 和 npgA 轉入麵包酵母後，成功地生產青黴素 penicillin G 的中間產物—具有 β-內醯胺的 amino-adipyl-cysteinyl-valine（ACV），奠定了本篇研究的基礎。

直接將來自青黴菌的 pcbAB 和 npgA 轉入麵包酵母菌（Sc.A1）後，在 LCMS 便偵測到了青黴素中間產物 ACV 的生成；然而，接著將 pcbC、pclA、penDE 轉入後之麵包酵母菌株（Sc.P1x）卻無法合成青黴素。原來是因為在青黴菌中，pclA 和 penDE 催化的反應位在過氧化體內，然而來自青黴菌將蛋白質導引至過氧化體的訊息胜肽無法在麵包酵母中發揮作用，因此作者將此二酵素之訊息胜肽換成麵包酵母本身的 PTS1 胜肽後，基因轉殖麵包酵母菌株（Sc.P1）便成功地生產出少量的青黴素（~90 pg/mL）（圖二）。

接著，利用 Golden Gate 基因重組技術，將合成路徑中的三個酵素基因 pcbC、pclA、penDE 與八種不同的啟動子（包含持續表現型、誘導型，並且根據啟動子強弱分成三組）進行組合搭配，篩選出青黴素產量（3 ng/mL）最高的菌株（Sc.P2）後利用定序技術找出對應之啟動子（圖三）。最後，直接將麵包酵母之培養液分離後混入化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的培養液中，與各種濃度標準品之青黴素比較活性成分之濃度（圖四）。

青黴素在發現九十年後的今天仍然是第一線的抗生素藥物，然而越來越多的抗藥性菌株產生勢必需要更多元的抗生素才足以應付，而非核醣體肽抗生素的合成有機會藉由不同的非核醣體肽合成酶組合出新種的抗生素，因此雖然早已可以利用直接培養 P. chrysogenum 或利用酵母菌 Hansenula polymorpha 大量生產青黴素，然而本篇研究的價值在於成功將多細胞真菌的合成路徑完整的搬到工業上常見並且研究相當透徹的單細胞麵包酵母內，提供後續利用表達不同 NRPS 以開發新種抗生素的基礎。

參考資料：

1. Hur, G. H., Vickery, C. R., & Burkart, M. D. (2012). Explorations of catalytic domains in non-ribosomal peptide synthetase enzymology. Natural Product Reports, 29(10), 1074-1098. doi:10.1039/c2np20025b
2. Awan, A. R., Blount, B. A., Bell, D. J., Shaw, W. M., Ho, J. C., McKiernan, R. M., & Ellis, T. (2017). Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker’s yeast. Nature Communications, 8, 15202. doi:10.1038/ncomms15202

撰文 │ 林映希