2016 年唐獎回顧報導 － CRISPR-Cas 的研究發展與創新應用

CRISPR 可說是近十年來最熱門的研究課題，原本是細菌用來抵禦外來基因的免疫機制，後來發現 CRISPR 系統可以精準剪斷特定基因片段，被譽為「分子剪刀」。這把分子剪刀除了可以用來編輯基因序列之外，還可以調控細胞的基因表現，甚至在醫學上用來治療遺傳性疾病，以及稍早刊出的 COVID-19 檢測等等，可以說是全方位的工具。本文回顧近年來 CRISPR 的研究進展，並介紹一些 DNA/RNA 基因編輯、調控，以及醫學上的應用。

 

CRISPR 再進化

CRISPR 可以精準的切開 DNA，靠著的是一段導引 RNA（guide RNA, gRNA），gRNA 上的 spacer 序列和標的 DNA 序列互補結合之後，Cas 酵素便會作用在 protospacer adjacent motif（PAM）序列的三個鹼基對之前，切斷該處的 DNA。除了最為人熟知的 CRISPR-Cas9 之外，CRISPR-Cas12a 及 Cascade-Cas3 也是常見的系統，作用機制略有不同，如圖一所示。CRISPR-Cas9 在應用上有個缺點：標的序列必須具有 5’-NGG 的 PAM 序列才能使 Cas9 作用（N指任何含氮鹼基），在人類的基因序列的應用有限，而且容易有脫靶效應（off-target effect）。近年來，CRISPR 經過改良後取得了長足的進步。舉例來說，張峰（Feng Zhang）[1] 及珍妮佛·道納（Jennifer Doudna）[2] 等團隊設計了 Cas9 突變體，大大提升了 CRISPR 的專一性，並降低錯誤剪輯的機率。David Liu 的團隊則是設計了針對不同的 PAM 序列 Cas9 突變體，讓 CRISPR 能更廣泛的應用在人類的基因序列上。

CRISPR 編輯 DNA 基因序列

有了 CRISPR 這把精準的分子剪刀，編輯基因序列再也不是夢。在 CRISPR 切斷 DNA 之後，細胞自身的 DNA 修復機制便會啟動，填補同源的 DNA 序列（同源性修復，homology-directed repair, HDR），或是隨機插入鹼基（非同源性末端重組，non-homologous end joining, NHEJ），如圖二所示。利用不同的修復方式，科學家可以巧妙設計實驗進行基因編輯，進行以下應用：

1. 剔除基因：研究某個基因的作用時，常常會剔除那個基因並看細胞表現如何受影響。CRISPR 可以剪輯該基因的外顯子（exon），非同源修復會隨機插入鹼基，造成框移突變（frameshift mutation），阻斷基因表現。如果要踢除比較長的基因，也可以使用一對 gRNA 將整段基因序列切除。
2. 插入基因：螢光在近代科學常被用來標定生物分子。CRISPR 可以直接修改基因序列，插入螢光蛋白的序列，與標定物形成融合蛋白。其中一個作法，名為 homology-independent target integration （HITI），利用 CRISPR 剪開基因序列，藉由非同源重組的方式，讓螢光蛋白的序列與剪開的序列接合。另一個改良的方法是利用同源修復，將螢光序列前後加上與斷面同源的 DNA，比起非同源結合更能準確控制。
3. 編輯單一含氮鹼基：許多遺傳疾病源自於基因序列中單一含氮鹼基的突變，稱為點突變（point mutation）。因此，無論是在研究上製造點突變來研究致病機轉，或是在醫療上修正致病的基因點突變，都十分的重要。David Liu 的研究團隊開發了一個編輯鹼基（base editing）的方法 [3]，使用不具核酸分解活性的 Cas9 突變體（dCas9，詳見後文），並與 APOBEC1 酵素結合，dCas9 被導引到標的 DNA 序列上時，APOBEC1 能將胞嘧啶（C）轉換為胸嘧啶（T）。此系統還結合了尿嘧啶醣苷酶（uracil glycosylase，UGI），抑制細胞修復突變鹼基的機制，可以達到 15-75% 的轉換率。該團隊最新的系統（BE4max）甚至能達到90%左右的轉換效率 [4]。
4. 分子記錄器：CRISPR 也能用來記錄分子等級的資訊。舉例來說，Timothy Lu 的團隊設計了一段特別的基因序列，這段序列會轉錄成 gRNA，引導 CRISPR 作用在同一段序列上，因此稱為 self-targeting guide RNA （stgRNA）[5]。stgRNA 會在細胞反應時活化，像是熱休克反應（heat shock response）或者發炎反應，stgRNA 活化後 CRISPR 就會剪輯 stgRNA 的序列，非同源重組後插入的鹼基數量就留下了分子紀錄，再使用 DNA 定序就能得知細胞反應的情形。另一個分子記錄的應用，則是來自 George Church 的團隊，他們將影像資訊儲存在基因序列之中，詳見之前的報導：https://bit.ly/3h83aP2。

CRISPR 也能編輯 RNA

CRISPR 分子剪刀不只可以剪斷 DNA，也可以剪斷 RNA。除了利用針對 RNA 的 CRISPR 系統，例如異種同源的 Cas9 及 Cas13，科學家們也發明了 RCas9，藉由設計含有 PAM 序列的寡核苷酸，讓他與單股 RNA 結合，使 Cas9 去切除該單股 RNA。有了這些工具，利用 CRISPR 編輯與調控 RNA 的應用。舉例來說，CRISPR 可以切除 RNA，阻止 RNA 轉譯，消滅致病的 RNA。其他的應用包括消滅病毒 RNA 在細胞裡的增生，以及使用不具核酸分解活性的 RCas9 則可以用來螢光標定 RNA。

 

CRISPR–Cas 於基因調節的應用

         除了利用 CRISPR-Cas9 辨識並切割 DNA 的特性來作為基因編輯的工具外，還可以將其應用於基因調節上。將 Cas9 的核酸酶域 RuvC (D10A) 和 HNH (H840A) 突變，可以使其喪失分解核酸的酵素活性，但仍然保有精準的 DNA 辨識能力，這樣經過突變修改的 Cas9 我們稱其為 dCas9 。 dCas9 等於是一個可辨識 DNA 的複合體，將它與各式功能的蛋白融合在一起，例如轉錄的抑制或活化因子、表基因修飾物、螢光團，如此一來，便大大地擴展了 CRISPR–Cas 的應用層面。

dCas9 可作為調節轉錄的有利工具，藉由與不同功能的蛋白結合，可以抑制或活化轉錄的進行，也可以利用表基因修飾來調節基因的表現。

單純只有 dCas9 和 DNA 的結合便可產生立體障礙，阻擋 RNA 聚合酶的進入。這種方式有效地抑制了原核細胞的轉錄作用，然而，在真核細胞中的效率卻很低。因此，科學家們在 dCas9 上融合一些常見的轉錄抑制因子增強其抑制能力，例如 KRAB (Krüppel-associated box ) 、MECP2 (methyl-CpG-binding protein 2) ，它們可以針對目標基因本身或基因調節區進行抑制。

同理，我們也可以藉由將 dCas9 與轉錄活化因子融合，例如 p65 和 VP64。這種多樣的活化功能更可擴展應用於細胞重編程，誘導細胞的分化。科學家們就成功利用此種方式將老鼠的纖維母細胞誘導分化成神經細胞。

除此之外，精準的表基因修飾也是調控基因表現的方法之一，例如乙醯化、甲基化核蛋白和甲基化 DNA。dCas9 與人類核蛋白乙醯基移轉酶 p300 (human histone acetyltransferase p300)、甲基胞嘧啶二氧酶 (methylcytosine dioxygenase TET1) 的融合可以活化轉錄。此方法有潛力應用於醫療之上，就以脆弱　X　染色體症候群 (fragile X syndrome) 為例，患者常發現於 FMR-1 基因區塊產生三核苷酸 (CGG) 異常擴增的現象，這時若以 dCas9–TET1 去甲基化 CGG 異常擴增區域，便可以促使此基因的表現。至於抑制轉譯的部分，可以使用前述的 dCas9–KRAB 再結合 DNA 甲基轉移酶 (DNMTs)，甲基化 DNA 來達成更穩定的基因靜默。藉由 dCas9 的基因辨識能力再加上多種表基因修飾蛋白，提供了表基因研究強大的工具。

以 Cas9 為基礎所建立的基因調控系統如同開關一般，可以辨識目標基因，並且調控它的表現。然而，這個開關是怎麼得知何時要開啟的呢？科學家們設計了幾套策略，使 Cas9 在接受到特定刺激時才得以作用，常見的刺激方式有化學分子誘導以及光調控。

利用某些化合物，例如去氧羥四環素 (doxycycline) ，誘導 Cas9 蛋白的表現，進而控制 Cas9 的基因調節作用，此種方法就曾成功應用於人類多能性幹細胞 (human pluripotent stem cells) 和成鼠細胞中。另一種以化學分子控制的方式是將分裂的 Cas9 結構各自接上不同的活化子，此兩種活化子都可以與同一化合物結合，故當環境擁有此化合物時，便會促使兩分裂結構偶合，讓 Cas9 的功能完整表現。

此外，光誘導 dCas9 系統也有相當高的利用價值，不只可以擁有時間上的控制，還提供了空間上調控的可能性。其中一種光調控的機制就是將植生性的細胞色素 CRY2 與轉錄活化因子 p65 或 VP64 連接，再將 CIB1 與 dCas9 相接，如此一來，當光照誘導 CRY2 與 CIB1 結合時，就可以產生 dCas9–p65 或 dCas9–VP64 的複合體，進而活化基因的表現。

這些化學調控及光調控系統不只讓科學家們可以更精準地控制基因，在研究上有相當廣泛的應用，它也提供了疾病治療一線曙光。

CRISPR–Cas 於基因體研究的應用

CRISPR–dCas9 基因調節系統不僅提供轉錄調控有力的工具，它對於基因體研究也有很大的貢獻。

         因為 dCas9 系統可以在不突變 DNA 的前提下，進行精準的轉錄調節，因而可以用來研究基因體非編碼區域的功能。

染色質的結構會影響基因體的功能，然而，因為一直以來缺乏合適的工具來研究 DNA-蛋白質的交互作用，導致這方面的知識較為落後。但近幾年 dCas9 系統的發展，使染色質交互作用的實驗得以進展。將蛋白與 dCas9 標籤融合以辨識 DNA ，再以抗體與此蛋白相結合，此種方法稱為 enChIP (engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation)，能夠研究蛋白質與特定基因座的專一性交互作用。除此之外，可以透過不同的 gRNA 讓 dCas9 辨識遠端的染色質，並設計它們上面融合的蛋白在接受到特定刺激時，可以相結合，使染色質形成環圈構造，如此一來便可以操縱不同基因座之間的交互作用，並且更深入地了解染色質構型對於基因調節的影響。

另外，dCas9 系統也可以應用於基因座成像上。藉由 dCas9 與螢光蛋白的融合，可以提供活細胞中的基因體成像。

 

CRISPR–Cas 於生物醫學的應用

以 CRISPR-Cas 立基的基因編輯和表基因修飾功能，提供能操控基因體的能力，也為生物醫學領域打開了一道窗，促進了基因治療與細胞治療的發展。

在基因治療方面，CRISPR-Cas 曾被利用於多種疾病的臨床前研究。例如色素沉著性視網膜炎 (retinitis pigmentosa)，科學家在視網膜退化的小鼠中，利用 Cas9 去干擾 Nrl 基因，成功使小鼠保有正常的錐狀細胞光受器功能。也利用 Cas9 HITI 插入的方式修補了 Mertk 激酶基因，使 MERTK 的功能恢復。

儘管 CRISPR-Cas 已有相當多臨床前研究，然而，仍有許多障礙與疑慮等待排除，才能更廣泛地應用於臨床治療。

首先是載體的部分，現今最常使用的基因治療載體是腺相關病毒 (Adeno-associated virus, AAV) ，因為它可以用於多種組織，先前研究也顯示它的安全性與有效性相當高。然而，它能乘載的基因資訊相當有限，因此只能使用較小的 Cas9 ，例如金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 與空腸彎曲桿菌 (Campylobacter jejuni) 的 Cas9。另外，使用病毒載體還是有一定的危險性，若 AVV 載體插入基因體或 Cas9 持續性地表現，可能會造成嚴重的後果。因此近年來，科學家們還有應用脂質奈米微粒 (lipid nanoparticles) 來作為載體，也持續努力發展更多更有效的非病毒載體。

脫靶效應一直是 CRISPR-Cas9 相當大的疑慮，這可能會造成基因體的變異，因此科學家們不僅需要更透徹地了解脫靶效應的影響與風險，還需要加強事前的 gRNA 篩選以提高辨識能力，以及發展更準確的方法去偵測脫靶現象。

此外，對於 Cas9 蛋白的免疫原性也是個潛在的問題。 小鼠對於 Cas9 的免疫反應已研究地相當透徹，然而應用於醫療所帶來的風險仍然不清。對於此問題，可能的解決辦法有編輯修改 Cas9 的抗原決定區，還有使用免疫抑制劑。

         現今已有一些 Cas9 的臨床測試。常見的應用策略是利用 Cas9 基因編輯細胞，使其擁有治療功能，再將其轉殖回活體內，這種方式能降低基因編輯的危險性。例如臨床上就曾利用轉殖基因插入 T 細胞的方式，產生嵌合抗原受體 T 細胞 (chimeric antigen receptors)，用以對付癌症。另外還有一個相當重要的醫療應用，是利用基因編輯的方式將白血球抗原系統的基因剔除，以產生廣用型供體細胞 (Universal Donor Cell)。現今也有人類臨床試驗利用 CRISPR–Cas 基因編輯治療失明。

 

結語 

         CRISPR-Cas 系統大大地擴展了基因工程領域，不僅是常利用於基因編輯的第二型 CRISPR-Cas 系統，許多創新技術的發展，例如可以辨識 RNA 的 Cas13a 工具、應用於基因調節的 dCas9，都讓這套系統擁有更廣泛地應用。至於最為人所關注的醫療應用， CRISPR-Cas 系統可以修正遺傳疾病的突變還可以應用於細胞治療，擁有十足的潛力。臨床前實驗結果證實此套技術的成效，然而，在安全及效率等層面仍需要更多的研究，例如脫靶效應的風險仍需要審慎評估。CRISPR-Cas 系統本身強大的功能再結合許多創新的改良，提供了基因體研究有力的工具，更大大地促進了基因治療與細胞治療的發展。

 

參考文獻

1. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., & Zhang, F. (2016). Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science (New York, N.Y.), 351(6268), 84–88. https://doi.org/10.1126/science.aad5227
2. Chen, J. S., Dagdas, Y. S., Kleinstiver, B. P., Welch, M. M., Sousa, A. A., Harrington, L. B., Sternberg, S. H., Joung, J. K., Yildiz, A., & Doudna, J. A. (2017). Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy. Nature, 550(7676), 407–410. https://doi.org/10.1038/nature24268
3. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., & Liu, D. R. (2016). Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 533(7603), 420–424. https://doi.org/10.1038/nature17946
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5. Perli, S. D., Cui, C. H., & Lu, T. K. (2016). Continuous genetic recording with self-targeting CRISPR-Cas in human cells. Science (New York, N.Y.), 353(6304), aag0511. https://doi.org/10.1126/science.aag0511

 

撰文｜陳薏晴、周文鴻
審稿｜熊浩安