以電腦運算輔助設計蛋白質開關

蛋白質是自然界的產物，但科學家希望能借鏡天然蛋白質的特性，設計出可調控的全新蛋白質，這就是「從頭蛋白質設計」(de novo protein design) 的研究主軸。要設計出一個在特定環境下能夠改變構形的蛋白質並不容易，但華盛頓大學 (University of Washington) 的 David Baker 教授及其團隊 [1]，利用特殊的設計理念與電腦運算突破了這個瓶頸。

該團隊在先前的研究當中設計了一些以氫鍵進行交互作用的 α-螺旋（α-helix）[2]，只要置換一些胺基酸來改變氫鍵的 donor 與 acceptor，或是改變 α-helix 的長度，就能調整 helix 間交互作用的強度，以利構形改變。這樣的 α-helix 便可作為蛋白質之間的可微調介面，因此被團隊應用於設計本篇所要介紹的蛋白質開關 [3]。

這個新的蛋白質開關（switch），具有 cage 和 latch 兩個主要的功能區塊（如圖所示），會透過特定的胺基酸進行分子內的結合，而 cage 也能與另一個外加的 key 蛋白質進行分子間的結，意即 key 會與 latch 競爭和 cage 結合的位置。由於結合時主要仰賴的是由數個氫鍵所形成的網絡 (hydrogen-bond network)，key 與 cage 的結合也就具有專一性，對此，團隊就使用了 Rosetta 軟體來運算蛋白質結構，設計出不同的 switch-key 配對並稱之為 LOCKR (latching orthogonal cage-key protein)，要以相對應的 key 才能開啟不同的 switch。為了讓 switch 具備特殊功能，團隊也透過 Rosetta 的輔助，將一段會與 target 結合的功能序列置入 latch 中合適的位置，當 latch 與 cage 失去分子內的結合，產生構形改變，功能序列就會暴露出來與 target 進行結合，進而產生作用。

另外，在 LOCKR 系統中，分子內或分子間的結合與分離都可用一個反應平衡常數來表示（圖中的 K_open、K_CK 與 K_LT），因此在 latch 上做點突變和修改長度，以及修改 key 的長度，就能微調它們與 cage 的交互作用，進而改變 K_open 和 K_CK，藉此找到 latch 和 key 的最佳設計。

團隊接著進行了三種功能性的測試。首先，以已知會互相結合的 Bim 和 Bcl2 兩蛋白質測試，將 Bim 序列置入到 latch上，透過生物膜干涉技術 (BioLayer Interferometry, BLI ) 偵測到在有 key 的存在下，switch 與 Bcl2 的結合提升了 40 倍 [註一]，代表 LOCKR 系統確實能透過 key 調控蛋白質的結合。接下來，團隊在 latch 上置入了 cODC degron [註二] 的序列，會被 26S proteasome 辨識而降解 。團隊利用不同的螢光蛋白標記 switch 和 key，並表現在酵母菌和 HEK293T 細胞中，發現當 key 被表現之後，帶有 degron 的 switch 螢光訊號就會因為 cODC degron 序列暴露、被降解而下降，代表此系統也可以用來調控細胞中的蛋白質降解。最後，團隊也嘗試用 LOCKR 系統改變蛋白質在細胞中的位置，於是將 nuclear exporting signal (NES) 置入 latch，利用螢光追蹤 switch 在酵母菌中的位置，發現當有 key 存在時，螢光訊號便因為 NES 的關係移往細胞質。

這項研究以電腦運算輔助，開發了一個能改變構形的蛋白質 LOCKR 系統，不僅具備了可調控性與專一性，還能套入不同的功能，將蛋白質設計的工藝往前推進了一大步。

 

註一：Bim 與 Bcl2 兩者的結合可促進細胞凋亡。
註二：cODC degron 為 ornithine decarboxylase C-terminus 的最後 37 個胺基酸，為一段 degradation signal。

參考文獻：

1. https://www.bakerlab.org
2. Boyken, S. E., Chen, Z., Groves, B., Langan, R. A., Oberdorfer, G., Ford, A., . . . Baker, D. (2016). De novo design of protein homo-oligomers with modular hydrogen-bond network-mediated specificity. Science, 352(6286), 680-687. doi: 10.1126/science.aad8865
3. Langan, R. A., Boyken, S. E., Ng, A. H., Samson, J. A., Dods, G., Westbrook, A. M., . . . Baker, D. (2019). De novo design of bioactive protein switches. Nature, 572(7768), 205-210. doi: 10.1038/s41586-019-1432-8

關鍵字：蛋白質設計、Rosetta

撰文｜陳柔含
審稿｜黃云宣