轉化利用溫室氣體的一線曙光：人造合成嗜甲醇菌

中研院院長廖俊智院士的研究團隊，利用合成生物學的技術將大腸桿菌改造，透過精準調控關鍵酵素表現，成功人造出合成嗜甲醇菌，有助於將溫室氣體轉化而成的甲醇更進一步有效利用，減緩氣候變遷並產出高價值的含碳化合物。

溫室氣體中以二氧化碳與甲烷最為惡名昭彰，因此單碳化合物的轉換消耗是減碳的重要策略之一，其中甲醇的生物轉化（bioconversion）長期受到重視。甲醇能自二氧化碳與甲烷轉化而來，常溫下是比氣體更方便儲存運送與受微生物利用的液態，在工業上也有廣泛用途；此外，研究指出天然嗜甲醇菌的甲醇代謝途徑與一般醣類代謝僅有三個酵素（Medh、Hps、Phi）的差異，以此作為開端，人工合成嗜甲醇菌（synthetic methylotrophy）成為眾所挑戰的目標。縱使瞭解了甲醇代謝途徑，不同含碳化合物代謝途徑彼此之間的制衡影響仍然未知，以致無法完全規避一般醣類代謝途徑，人工合成株在單一甲醇碳源下生長效率不佳，所以仍須借助額外碳源生長。中研院院長廖俊智帶領的研究團隊突破菌種代謝平衡瓶頸，成功改造出在甲醇單一碳源下生長速率比擬天然菌株的「合成嗜甲醇菌」[1]。

團隊先過量表現三個所需酵素以建立甲醇代謝途徑：RuMP 循環（Ribulose monophosphate cycle，核酮醣單磷酸循環），並破壞葡萄糖代謝途徑之一：PPP 途徑（Pentose phosphate pathway，磷酸戊糖途徑），以此在實驗室中培養並篩選出能消耗甲醇的大腸桿菌菌株。接著以先前發表的模擬分析方法：Ensemble Modeling for Robustness Analysis （EMRA）為策略 [2]，透過與天然代謝途徑及相關代謝網絡的比較，測試人造代謝途徑中各個酵素的穩固性（robustness），進而找出並調控關鍵酵素，以達成人造菌的胞內代謝平衡，逐步降低其對甲醇以外碳源的依賴性。

在菌株培養過程中，研究團隊發現這些人造菌株放大培養的狀況不佳，如過長的適應期（lag phase）、停滯期（stationary phase）中過多的死亡細胞，進行 RNA 定序獲得轉錄體資料後，團隊發現停滯期的特定基因表現量有明顯改變： RuMP 循環中，負責再製與甲醛反應的中間產物之基因表現量急劇下降，但相較下與甲醛生產有關的基因其表現量下降較少，這些變化從而導致了甲醇代謝中間產物：甲醛的累積。

團隊推測醛類引發的 DNA-Protein Crosslinking（DPC）是造成細胞死亡之因 [3]。 DNA 過於單薄，在穿透式電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope, TEM）並不可見，唯有當受蛋白質包覆時才足以被觀察到，而透過 TEM 的觀察也證實了 DPC 存在於人造菌株中 (Figure 1)。解決 DPC 的方法在於平衡甲醛通量，同樣借助 EMRA 的模擬分析，團隊進一步調控特定基因表現量，如負調控 Pfk、Gapdh 兩基因，使甲醛得以被消耗並保持不同代謝途徑之間的平衡，最終成功分離出倍增時間（doubling time）與甲醇耐受度良好的合成嗜甲醇菌 SM1 菌株。

Figure 1. 於合成菌株 CFC526.41 不同生長階段中觀察到的 DPC。Doi: 10.1016/j.cell.2020.07.010

值得一提的是，SM1 菌株基因中有段長 70kb 的連續重複（tandem repeat）序列出現了複製數為四的片段，此重複序列包含了一段人造插入的啟動子，團隊進一步分析發現，當 SM1 以一般 LB 培養時，此段 70kb 連續重複序列的複製數下降，但若轉回到甲醇基本培養基（mehtanol minimal medium），則其複製數再次上升，可見此段連續重複序列與甲醇生長性有所關聯，甚至與解決 DPC 有關，然此適應性與外在環境變化之間的關聯仍有待釐清。

人造嗜甲醇菌株 SM1 的合成可謂一大進展 (Figure 2)，未來針對其生長速度、碳源使用效率等的改良有助於工業上的應用，而在菌株的培養過程中同樣也有許多饒富興味的發現有待進一步探討，對於應用或基礎科學研究都是一個深富發展性的開端。

Figure 2. 合成嗜甲醇菌株篩選培養過程。Doi: 10.1016/j.cell.2020.07.010

Reference:

1.Chen, F. Y., Jung, H., Tsuei, C., & Liao, J. C. (2020). Converting escherichia coli to a synthetic Methylotroph growing solely on methanol. Cell, 182(4), 933-946.e14. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.07.010
2.Lee, Y., Lafontaine Rivera, J. G., & Liao, J. C. (2014). Ensemble modeling for robustness analysis in engineering non-native metabolic pathways. Metabolic Engineering, 25, 63-71. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2014.06.006
3.Stingele, J., Habermann, B., & Jentsch, S. (2015). DNA–protein crosslink repair: Proteases as DNA repair enzymes. Trends in Biochemical Sciences, 40(2), 67-71. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2014.10.012