#本文特別邀請原文第一作者陳暐婷博士協助審稿，感謝國立陽明大學腦科學研究所李倧輔協同撰寫。
阿茲海默症（Alzheimer’s disease，AD）是常見的神經退化性疾病，而類澱粉蛋白（amyloid plaques）於腦內不正常堆積是導致阿茲海默症的主要原因之一，並觸發其周圍的發炎反應，然而，其中的分子機制尚不明確。過去的研究以造成發炎反應的細胞為目標，例如類澱粉蛋白周圍的神經細胞或微膠細胞（microglia）等，利用次世代定序去探究類澱粉蛋白與發炎反應的分子機制，但實際上能完整純化（isolate）這些細胞並保有足以定序的 mRNA 品質仍有一定的技術難度，也忽略了這些細胞在腦內空間上的關聯性。於比利時魯汶腦科學研究中心擔任博士後研究員的陳暐婷，在 Bart De Strooper 所領導的團隊，於 2020 年八月發表於《Cell》期刊的研究，便使用空間轉錄（Spatial transcriptomics）和原位定序（In situ sequencing）這兩個技術去突破這些瓶頸，探討類澱粉蛋白在阿茲海默症腦中神經退化機制所扮演的角色 [1]。
首先，研究人員分別收集來自原生型（Wild type，C57BL/6）和 App 基因轉殖 [2] 小鼠於3、6、12及18個月大之腦片， 而 App 基因轉殖小鼠直至六個月大時便有類澱粉蛋白堆積（plaques）、神經膠細胞活化（gliosis）、突觸喪失（synaptic loss）及認知功能退化等與阿茲海默症相似的表現型 [2]。
空間轉錄（spatial transcriptomics）這項技術使研究人員得以從組織切片上獲得完整的轉錄組（transcriptomics）數據及分佈，主要機制是分辨出完整切片上的 mRNA ，再接上特定的 DNA probe 做 cDNA 合成以進行後續的分析 [3]。實驗設計將每個腦片細分為數個 tissue domains（TD），每個 TD 各自有一套完整的轉錄組（ST），來自 6,578 ± 987 個基因，以及經由免疫染色法所推得的澱粉樣蛋白-β（amyloid-β，Aβ）的指標（Aβ index），藉此推算細胞的基因轉錄組如何隨著類澱粉蛋白的堆積改變（圖一）。
圖一、實驗流程 分別收集3、6、12及18個月大之 WT（C57BL/6）與 App 基因轉殖（ AppNL-G-F）小鼠腦片，每三片有一片作為 Spatial transcriptomics，另外兩片則作免疫染色（immunostaining），觀察 amyloid plaques 周圍隨著年紀的基因與細胞的變化 [1]。
接下來，以基因型差異為一組（Wild type vs. App 基因轉殖），再以類澱粉蛋白堆積進程為一組（Aβ model），比較兩者間的基因表現差異分析，因此可以得到以基因型、Aβ 堆積（Aβ exposure）和年紀關聯的基因表現變化，將這些 ST 數據根據 Gene ontology（GO）依基因功能分類，發現與抗原處理、化學趨化性（Chemotaxis）、溶酶體降解以及發炎反應等功能會隨著 Aβ 堆積和年紀（至18個月）而上升，也發現髓磷質（myelin）於 3 個月時上升但隨著 Aβ 堆積而下降。同時，將具有相似功能的基因依據 WGCNA 分模組（module）。
於此，研究人員將 WGCNA 其中與 Aβ 堆積相關的基因稱作 plaque-induced genes（PIGs）。這些 PIGs 會隨著年紀上升，並發現 18 個月大 App 基因轉殖小鼠的所有 TD 中 Aβ 堆積與 PIGs 相關，且 PIGs 的細胞特徵與微膠細胞有強烈的關聯性，並和人類基因庫對照找出相應的基因。
為了探討類澱粉蛋白周圍的細胞反應，研究人員使用原位定序（In situ sequencing，ISS）這個技術，機制與空間轉錄類似，主要是用於辨識特定位置之細胞種類。探討 18 個月大原生型與 App 基因轉殖小鼠 PIGs 周圍的細胞種類，以 Aβ 為中心，做出同心圓，並發現類澱粉蛋白周遭主要是微膠細胞與星狀細胞（astrocyte）聚集。研究團隊對 PIGs 進行了 WGCNA 分析，並根據 ST 中的 TD 分為WT以及四個不同程度的Aβ堆疊。透過圖像顯示出伴隨 Aβ 堆積，PIGs 內的網絡連結也會逐漸增強（圖二）。
圖二、不同 Aβ index 下，PIGs 間的共同表現。 依據 WGCNA 分析，研究人員將 PIGs 分成三個子群體（藍色、橘色：表現在微膠細胞的 PIGs，綠色：表現在星狀細胞的 PIGs），綠線代表基因組間的連結強度可以知道伴隨著 Aβ index 的增加（Q4-Q1），PIGs 的共同表現會明顯增加 [1]。
此外，WGCNA 分析改變第二多的基因組多表現在寡樹突膠細胞（oligodendrocyte），並稱這一群基因模組為 OLIG module。研究人員進一步將 OLIG 與過往發表的人類 AD 相關寡突狀基因（AD associated oligodendrocyte）比較，顯示 OLIG 與其具有高度相關。與 WT 小鼠相比，3 個月和 18 個月大 App 基因轉殖小鼠的 OLIG 基因模組在基因型表現以及全腦分布整體上升。然而，當研究人員單獨分析 AD 小鼠中 Aβ 堆積對全腦區域的影響時，卻發現 OLIG 在 3 個月大時呈現正相關，但在 18 個月時呈現負相關，此差異在不同的大腦區域也有明顯不同。研究人員因此推定，在輕度的 Aβ 堆積下，OLIG 會被活化並且相互影響；但在高密度 Aβ 堆積的微環境中，這樣的表現會因此减少。部分 OLIG 的腦區差異與不同程度的 Aβ 堆積有關。
為了佐證他們的結果，研究人員對 AD 患者以及正常人大腦的額上回（superior frontal gyrus）組織進行基因表現分析。透過 ISS 分析，除了發現人類與小鼠間的基因表現具有一定的差異。相比於正常人腦組織，研究團隊發現 AD 患者的星狀細胞和微膠細胞中的特定基因會大量表現，這項發現顯示 AD 患者腦中疾病相關的膠狀細胞會被活化。而在 OLIG 中，作者利用 ISS 分析了42個人類同源基因的细胞表現，在類澱粉斑塊周圍有22個具有明顯的基因表現缺乏，5個基因在類澱粉斑塊周圍中顯著表現增加。研究人員發現，基因模組中容易受到 AD 調控的 APOD 基因，不只表現在寡樹突膠細胞，更表現在微膠細胞上，而正常腦組織中並無此發現。
實驗結果顯示出人類與小鼠之間的物種差異，人類的 AD 致病過程可能長達二十年，難以藉由壽命僅約兩年的小鼠完全模擬，隨之而來的 Tau 蛋白與壞死性細胞凋亡更加劇了疾病的複雜性。即使如此，研究人員仍成功地利用新穎的技術闡明腦內類澱粉蛋白堆積進程對於周圍細胞以及基因的顯著變化，以及此 AD 病理特徵在治病過程所扮演的角色。
參考文獻：
[1] Chen, W. T., Lu, A., Craessaerts, K., Pavie, B., Sala Frigerio, C., Corthout, N., . . . De Strooper, B. (2020). Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer’s Disease. Cell, 182(4), 976-991 e919. doi:10.1016/j.cell.2020.06.038
[2] AppNL-G-F 小鼠介紹，https://www.alzforum.org/research-models/app-nl-g-f-knock
[3]Stahl, P. L., Salmen, F., Vickovic, S., Lundmark, A., Navarro, J. F., Magnusson, J., . . . Frisen, J. (2016). Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science, 353(6294), 78-82. doi:10.1126/science.aaf2403
撰文｜黃子瑄、李倧輔
審稿｜陳暐婷、洪維謙
