裘馨氏肌肉失養症（Duchenne Muscular Dystrophy, DMD）是一種因 X 染色體上的 DMD 基因異常所導致的神經及肌肉疾病。DMD 基因的異常導致細胞無法正常製造失養素（dystrophin）蛋白。失養素蛋白透過與細胞肌動蛋白（actin）與細胞外基質的層粘連蛋白（laminin）作用來維持肌纖維膜恆定。缺乏失養素的肌纖維膜會無法承受長期的施力而導致肌肉細胞死亡。此性聯遺傳疾病的發生率約為每 3500-5000 名男性中一例。患者會因為肌肉細胞受損從 3-5 歲開始出現漸進式的肌肉無力，漸漸無法自行站立走動。最終在患者約 20 多歲時，發展成致命性的呼吸障礙及心臟衰竭。
DMD 基因是人類已知最大的基因，全長約 230 萬個鹼基，帶有 79 個外顯子（exon），需要 16 個小時才能完成轉錄 [1]。任何在這個基因中的變異，包括了大小片段的缺失（deletion)、插入（insertion）、重覆（duplication），最終多會影響基因轉錄的開放閱讀框（open reading frame, ORF），使細胞無法製造出正確的失養素蛋白。臨床端已上市的治療方法包括類固醇補充與注射針對特定外顯子的嗎啉基反譯核酸（Morpholino antisense oligomer），誘導 DMD 基因在轉錄過程出錯的外顯子（exon skipping），進而讓細胞製造出仍有部分功能的失養素蛋白 。前者只能延緩症狀，後者除了作用效率差無法真正治癒疾病，且現行藥物僅針對第 51 號及 53 號外顯子突變的基因型 [2]。
為了朝治本的方向前進，目前數個已在臨床試驗階段的療法多為基因添加療法（gene-addition therapy），即使用腺病毒載體（adeno-associated virus, AAV）攜帶 DMD 基因進入細胞並恢復正常 DMD 基因的表現。這種基因治療方法的效果受限於腺病毒載體的運載能力，而 DMD 基因轉錄的 mRNA 全長達 1 萬 4 千個鹼基，所以目前的幾個臨床試驗使用了不同版本的迷你型 DMD 基因。這樣的基因治療是否能長久恢復 DMD 基在肌肉細胞的正常表現呢？它們的療效仍然有待觀察 [3]。
除了基因添加療法，近年來以 CRISPR Cas9 為主的基因編輯進展也提供了治癒 DMD 的另一種可能性。在 CRISPR-Cas9 系統用 sgRNA 精準地引導 Cas9 在 DMD 基因上進行修正，可直接在基因體層級上剔除 DMD 已變異的外顯子。這個方法不像使用嗎啉基反譯核酸只能針對特定單一外顯子變異的基因型，理論上能持久地同時處理一個或多個有問題的外顯子基因，使更多其他基因型的病患受惠。由於剔除變異外顯子所使用的非同源性末端重組（non-homologous end joining, NHEJ）比起修正基因用的同源性修復（homology-directed repair, HDR）效率來得高，且不需要提供修正所需的同源模板基因片段，所以很快就成為基因輯推展用的目標。許多的細胞實驗甚至老鼠胚胎試驗已經驗證這個方法可恢復細胞失養素蛋白表現 [4]。然而對人類胚胎進行基因編輯尚有倫理爭論，且病患也需要有效的治療方法，凸顯了在體內（in vivo）肌肉細胞進行基因編輯的迫切性。
圖一、剔除 DMD 第23號外顯子的 sgRNA 設計。圖片來源：DOI: 10.1126/science.aad5143
為了探索體內基因編輯治療 DMD 的可行性，三個分別來自德州大學西南醫學中心 [5]、杜克大學 [6]、哈佛大學 [7] 的研團隊都用了腺病毒載體運送 CRISPR-Cas9 系統到肌肉來治療 DMD 突變的老鼠。他們所使用的 DMD 老鼠模型在 DMD 基因的第 23 號外顯子帶有一個無義突變（nonsense mutation），進而導致失養素蛋白無法完成製造。實驗中他們使用了兩個 AAV 載體，一個帶有剔除 DMD 基因第 23 號外顯子的 sgRNA，另一個帶有 Cas9 蛋白，並直接將 AAV 載體注射到 DMD 突變老鼠的肌肉。實驗結果皆顯示成功在肌肉細胞進行了基因編輯，基因轉錄時在 mRNA 拼裝（splicing）時跳過了被剔除的第 23 號外顯子，部份恢復了失養素蛋白在肌肉細胞的表達，被注射肌肉的活動能力也獲得改善。另外，在這兩個 AAV 載體進行腹腔注射（intraperitoneal, IP）後，DMD 突變鼠的心肌細胞的失養素蛋白表達也有了些許恢復。
這項研究證明了用 CRISPR 系統在體內進行基因編輯治療 DMD 這個概念的可能性。然而，AAV 運送載體系統的優化設計、如何輸送足夠劑量達到體內治療的效果、CRISPR 基因編輯脫靶效應（off target）、Cas9 在人體的免疫反應等諸多問題，仍須進一步探索。這些勢必是目前以 CRISPR 為題的生技研發項目中必不可少的考量。盼望有朝一日，裘馨氏肌肉失養症病患能在基因編輯的幫助下直接對付疾病的根本。
圖二、裘馨氏肌肉失養症患者的肌肉病理切片，可以觀察到很多肌肉纖維的部分經被脂肪取代。圖片來源：https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/49/Duchenne-muscular-dystrophy.jpg
延伸閱讀：2016 年唐獎回顧報導 － CRISPR-Cas 的研究發展與創新應用
參考文獻：
- The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced. Nature Genetics volume 9, pages 184–190(1995). DOI: 10.1038/ng0295-184
- RNA-targeted drugs for neuromuscular diseases. Science (2021) Vol. 371, Issue 6524, pp. 29-31. DOI: 10.1126/science.aba4515.
- Therapeutic developments for Duchenne muscular dystrophy. Nature review Neurology volume 15, pages 373–386(2019). DOI: 10.1038/s41582-019-0203-3
- Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9–mediated editing of germline DNA Science, 345 (6201) (2014), pp. 1184-1188. DOI: 10.1126/science.1254445
- Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science 22 Jan 2016: Vol. 351, Issue 6271, pp. 400-403. DOI: 10.1126/science.aad5725
- In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science 22 Jan 2016: Vol. 351, Issue 6271, pp. 404-407. DOI: 10.1126/science.aad5143
- In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science 22 Jan 2016: Vol. 351, Issue 6271, pp. 407-411. DOI: 10.1126/science.aad5177
撰文｜陳恩浩
審稿｜陳品萱
