DNA複製哨兵：Cdc7與CK1γ1共同調控Claspin並守護DNA複製

DNA複製的整個過程容易受到阻礙，而造成這些阻礙的因子被稱為DNA複製壓力 ( DNA replication stress ) [1]。除了本月開頭文所提到的複製壓力因子外，致癌基因所引發的異常複製起始點（Oncogene-induced unscheduled origin firing）也是造成複製壓力的因子之一。為了因應複製壓力帶來的潛在傷害，細胞會啟動複製檢查點（Replication checkpoint）相關蛋白的以進行DNA修復，例如 Chk1 激酶（Checkpoint kinase 1）磷酸化。來自東京大學及東京都醫學總合研究所的正井久雄教授團隊發現，Claspin 為複製檢查點路徑中一個重要調節蛋白，會受 Cdc7 及 CK1γ1 的共同調控且被磷酸化，以確保複製檢查點可以順利進行，此研究於 2019 年底發表於 Elife 期刊 [2]。

正井久雄教授的研究團隊已證實 Cdc7 與 Claspin 的關聯性，其可調控DNA複製起始並活化複製檢查點機制：Claspin 會透過本身的 Acidic patch（AP）區域（註一）召集 Cdc7 至 DNA複製起始點 [3] ，而 Cdc7 會將 Claspin 磷酸化以順利啟動DNA複製。此外，Claspin 的磷酸化也會誘導 Chk1 與 Claspin 結合（圖一）。

本篇研究則根據先前成果，利用複製壓力的誘導劑 Hydroxyurea（HU）阻礙 Cdc7 缺失的老鼠胚胎幹細胞與人類癌細胞株內的DNA複製，發現 Chk1 蛋白磷酸化降低，證實 Cdc7 與  Chk1 磷酸化的關連性。接下來，為了證實 Chk1 磷酸化降低與 Claspin 直接相關，研究團隊將突變的 Claspin 表現於細胞中，結果指出 Claspin AP 區域中的天冬氨酸（D）及谷氨酸（E）突變成丙氨酸（A）後便無法召集 Cdc7，更無法誘導 Chk1 磷酸化。究團隊更進一步透過質譜儀分析確認 Claspin 的磷酸化位點。團隊利用 HU 對細胞產生複製壓力並使用 siRNA 技術降低細胞中的 Cdc7 蛋白表現量，磷酸化效能計算的結果顯示 Cdc7 的缺失會導致多數在 Claspin AP 區域及 Chk1 結合位（Chk1-binding domain；CKBD）的磷酸化消失，而 CKBD 區域的磷酸化消失會導致 Claspin 無法順利與 Chk1 結合進且引發 Chk1 磷酸化（圖二）。 

此外，先前研究顯示 CK1γ1（Casein kinase 1γ1）也可藉由結合 Claspin CKBD 區域以參與 Claspin 及 Chk1 的結合 [4]。因此，研究團隊想探討 CK1γ1 是否參與 Chk1 磷酸化，並與 Cdc7 調控且活化複製檢查點。結果顯示，利用 siRNA 技術將人類骨癌與大腸癌細胞株中的 CK1γ1 表現量大量降低後，Chk1 磷酸化減少約 50%；以相同方法使  Cdc7 表現量降低後，Chk1 磷酸化降低約 80%。而同時降低 CK1γ1 及 Cdc7 表現量，則無法觀察到 Chk1 磷酸化。綜合以上結果，CK1γ1 及 Cdc7 不但共同調控 Chk1 的活化，且 Cdc 7在癌細胞的DNA複製過程中扮演主導 Chk1 及活化複製檢查點的角色。此外，由於上述實驗是在人類癌細胞中進行，為了闡明 CK1γ1 及 Cdc7 在人類正常細胞的作用，研究團隊將正常人類皮膚纖維母細胞（Normal human dermal fibroblasts；NHDF）內 CK1γ1 的表現量大幅降低後Chk1 磷酸化降低約 90%；而降低 Cdc7 表現量後，則降低 Chk1 磷酸化約 50%。因此，正常細胞中 Chk1 和複製檢查點的活化受 CK1γ1 主導；而癌細胞中則是 Cdc7 所主導。

如何在不損害正常細胞的情況下摧毀癌細胞生長是目前癌症療法的一大挑戰。在本篇研究中，雖然 CK1γ1 和 Cdc7 可以共同調控並活化複製檢查點，但在正常細胞及癌細胞中卻扮演不同程度的角色，由於 Cdc7 在癌細胞中主要調控並活化複製檢查點，因此 Cdc7 有作為只消滅癌細胞的標靶潛能，但其未來對於癌症治療的應用仍需要更多研究證實。

• 註一：Claspin 中的 Acidic patch 此段胺基酸區域富含天冬氨酸（Aspartic acid；D）谷氨酸（ Glutamic acid；E ）。這兩種胺基酸有多餘的羧基（Carboxyl group）並釋放一個質子，使自己帶負電，也因此被稱為酸性殘基（Acidic residues）。
• 註二：磷酸化的效能計算是利用帶有磷酸化 Claspin 除以 Claspin 的總量。

參考文獻：

1. Gaillard, H., García-Muse, T., & Aguilera, A. (2015). Replication stress and cancer. Nature Reviews Cancer, 15(5), 276-289. https://doi.org/10.1038/nrc3916
2. Yang, C. C., Kato, H., Shindo, M., & Masai, H. (2019). Cdc7 activates replication checkpoint by phosphorylating the Chk1-binding domain of Claspin in human cells. Elife, 8, e50796.  https://doi.org/10.7554/eLife.50796
3. Yang, C. C., Suzuki, M., Yamakawa, S., Uno, S., Ishii, A., Yamazaki, S., … & Masai, H. (2016). Claspin recruits Cdc7 kinase for initiation of DNA replication in human cells. Nature communications, 7(1), 1-14. https://doi.org/10.1038/ncomms12135
4. Meng, Z., Capalbo, L., Glover, D. M., & Dunphy, W. G. (2011). Role for casein kinase 1 in the phosphorylation of Claspin on critical residues necessary for the activation of Chk1. Molecular biology of the cell, 22(16), 2834-2847. https://doi.org/10.1091/mbc.e11-01-0048

撰文｜蕭皓文
審｜黃子瑄