當轉錄與複製同時在某段 DNA 模板上進行時，便可能發生轉錄─複製衝突（transcription-replication conflicts, TRCs），使 DNA 複製叉受阻，進而造成突變、重組、或 DNA 斷裂的現象 [1]。在真核生物中，部分基因由於 DNA 複製叉與轉錄延伸複合體頻繁地交會，致使該區域的染色體結構較易裂，這些位點也較易受癌化壓力（oncogenic stress）影響。酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）的 Mec1 與 Rad53 生物途徑，是緩解 TRCs 造成的結構張力的關鍵角色。其中，Rad53 在人類中的同源蛋白為 Chk1 激酶（Checkpoint kinase 1），參與細胞週期中的 DNA 複製檢查點。
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組蛋白 H3 第四號離胺酸上的甲基化修飾（H3K4me）是一種活化性的組蛋白修飾，在酵母菌中主要由 Set1C/COMPASS 複合體負責，並透過不同的調節子形成單甲基、雙甲基、三甲基的不同標記（H3K4me1/2/3）。H3K4me3 大量出現於轉錄起始點，而下游則是 H3K4me2 與 H3K4me1 等標記，形成 5’ 端至 3’ 端的 H3K4 甲基化程度梯度，然而其生物功能仍未明朗。
一篇於去年發表於 Nature Communications 的研究 [2]，試圖解析 H3K4 甲基化修飾在轉錄與 DNA 複製過程中所扮演的角色。研究團隊推論缺乏 Rad53 檢查點活性的酵母菌可能因複製叉受到阻滯，因而對於低劑量的羥基尿素（hydroxyurea, HU）甚為敏感。HU 會誘導細胞產生複製壓力，研究團隊在初步分析後，發現 H3K4 甲基化程度會影響 rad53 突變株對 HU 的敏感度。經過更進一步的檢視後發 H3K4me3 與 RAD53 的交互作用與 Mec1/ATR 的訊息傳導途徑無關，且細胞的存活率與 H3K4 甲基化程度呈負相關，顯示 H3K4 甲基化與 DNA 複製及細胞存活有關聯。
圖一、在 HU 誘導的複製壓力下，H3K4 甲基化程度下降會增進 rad53 突變株的細胞存活率。（a）在 RAD53 與 rad53 細胞中分別引入 H3 的數個突變，觀察其對於 HU 的敏感度。（b）顯示set1Δ、bre2Δ 、與 spp1Δ 等突變株的 H3K4me 程度。（c）在 RAD53 與 rad53 的遺傳背景下引入 set1Δ、bre2Δ 、與 spp1Δ 之突變，觀察 HU 壓力下的細胞生長情形。（d）各品系細胞經同步並在停滯於 G1 期後，出至含有 25mM HU 的培養基中，計算其細胞存活率。（e）各品系細胞滯於 G1 期並釋出至 0 mM 或 5mM HU 培養基後，分析 γH2A 表現量。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41467-020-14595-4
為了更進一步了解 H3K4me 與轉錄─複製衝突的關係，研究團隊透過實驗發現 H3K4 甲基化對於執行轉錄的 RNA 聚合酶和 DNA 模板的結合無關。然而，進一步分析 DNA 合成過程，則發現若 H3K4me 消失時，會使得 rad53 細胞中執行 DNA 複製的 DNA 聚合酶與 DNA 模板結合，並緩解複製叉阻滯的現象，顯示 H3K4 確實影響了 DNA 複製的過程。因此團隊推測 H3K4me 降低進而緩解 HU 壓力誘導 rad53 突變株產生的複製叉阻滯的現象，有可能是藉由改變染色質結構。透過定序數據分析，發現 H3K4 甲基化喪失對轉錄起始點（transcription start sites, TSSs）的色質結構僅有細微的影響，並觀察到無論是野生型的 H3K4 或是突變型的細胞，其 TSSs 與核小體的相對位置都很相似。綜合以上結果，H3K4 甲基化並不會顯著地影響染色質的結構（圖二）。
圖二、在複製壓力下，H3K4 甲基化造成 rad53 突變株複製叉發生阻滯，但未改變染色質結構。（a）在特定時間點，分析不同遺傳背景的細胞暫止於 G1 期後釋出至含有 25mM HU 培養基中兩小時所含的 DNA 組成。紫色箭號代表突變株複製較快。（b）DNA Pol2 和與起始序列辨識複合體結合的自主複製序列（autonomously replicating sequence, ARS）發生交互作用的譜。（c）經 HU 處理後在 TSSs ± 0.5 kb 處的 ATAC-seq 訊號（d）根據（c）圖進行數據分析所得係數。（e）TSSs 區域（−0.1 to 0.5 kb）中與起始序列辨識複合體結合情形的 ATAC-seq 訊號。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41467-020-14595-4
團隊更進一步觀察 H3K4 甲基化是否使細胞在 HU 誘導下出現異常的DNA複製，發現 H3K4me 可能致使經 HU 處理後的 rad53 突變株發生複製叉反轉（fork reversal；註一） [3]。研究團隊進一步設計了可誘導轉錄與複製機制分別發生相向及同向轉錄─複製衝突的系統。以二維電泳分析發現，同向衝突會使複製叉一貫地受到阻滯，而相向的衝突則會促進複製叉反轉，對於細胞基因體穩定性損害較大。團隊推測 rad53 突變的細胞經 HU 處理後，阻止複製叉前進的作用與 H3K4 甲基化度有關。
H3K4me 究竟能否直接促進複製叉異常事件的發生呢？研究結果指出在 HU 壓力下，轉錄作用與 H3K4 甲基化可能是透過獨立的作用機制，阻斷 rad53 突變株中複製叉的移動。研究團隊推論由密集轉錄活動留下的高量 H3K4 甲基化標記，可能在複製叉前進的過程形成緩衝，保護細胞免受 TRCs 的影響，並將這個概念稱為「減速丘模型」。在 HU 壓力下，Rad53 的活化可以協助維持複製體的穩定。不同的 H3K4me 標記，宛如一個個小丘，使高轉錄活性基因位點上的複製叉減速，保護可能發生 TRCs 的區域，而在轉錄活動較少處則允許複製叉快速通過。然而，缺乏檢查點時，H3K4 甲基化則會阻礙複製，並使複製體變得不穩定。
團隊進一步檢視這個模型，發現不論是否經過 200 mM HU 的處理及 Rad53 是否缺失， H3K4A 突變株在單一細胞週期中進行大量 DNA 合成的速度都比野生型（H3）來得快。解析二維電泳訊號以追蹤複製叉的動態後，發現經 H3K4 甲基化修飾的染色質模板，可作為複製叉前進的分子減速器（圖三）。
圖三、轉錄過程中留下的 H3K4me 標記可使行進中的複製叉減速。（a）減速丘模型的示意圖。H3K4 甲基化位點好比是行進中複製叉（圖中的黑車）的減速丘，而 Rad53 檢查點則可在複製壓力下維持複製體的穩定性，喪失 Rad53 時 H3K4me 則會為複製叉行進中的阻礙圖中的紅色爆破標示）。（b）分析各品系細胞於特定時間點在 ARS305 與 ARS1211 周圍區域產生的複製中間物。黑色箭號指突變株的 S 期進程較野生型快。（c）以二維電泳分析鄰近 ARS305 與 ARS1211 兩個複製起始點的複製叉前進情形。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41467-020-14595-4
這項研究解析了 H3K4 甲基化如何透過減緩複製叉的速率，減少 TRCs 的發生，並確保複製的準確性。在真核生物中，當細胞處於 S 期時，數個複製起始點會被偕同活化，使整個基因體可以隨細胞週期進行複製。在不同的基因體區域，轉錄活動程度也有所差異。這個過程需要精確的調節，以維持基因體的穩定性。H3K4me 在其中扮演的角色又是什麼呢？研究團隊經過遺傳與生化分析，提出了「速丘模型」，並闡釋了先前未知的機制：在活化的基因上所觀察到的 H3K4 甲基化梯度，可避免轉錄與複製機制發生衝突。這項發現為H3K4 甲基化與基因體不穩定性之間的關係奠定了重要的基礎，若能在癌細胞中驗證這個發現，不但表示這個機制在演化中是具有保守性的，更有機會成為癌症的療法。
註一：在 DNA 損傷時，複製叉反轉可以增加對於損傷的耐受性並促進修復的過程，是一種避免複製叉崩塌的 DNA 自我保護機制；然而，反轉的複製叉同時也具有被核酸酶降解與發生 DNA 雙股斷裂的風險。
參考文獻：
[1] Kim, N., &Jinks-Robertson, S. (2012). Transcription as a source of genome instability. Nature Reviews Genetics, 13(3), 204214. https://doi.org/10.1038/nrg3152
[2] Chong, S. Y., Cutler, S., Lin, J.-J., Tsai, C.-H., Tsai, H.-K., Biggins, S., …Kao, C.-F. (2020). H3K4 methylation at active genes mitigates transcription-replication conflicts during replication stress. Nature Communications, 11(1), 809. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14595-4
[3] Rickman, K., &Smogorzewska, A. (2019). Advances in understanding DNA processing and protection at stalled replication forks. Journal of Cell Biology, 218(4), 1096–1107. https://doi.org/10.1083/jcb.201809012
關鍵字：2021/05/DNA replication 主題月、transcription-replication conflicts、H3K4 methylation、speed bump model、Genome instability
撰文｜陳品萱
審稿｜蕭皓文
