精氨酸甲基轉移酶在DNA複製叉上的快思慢想

 

在細胞進行DNA複製遭遇壓力時，複製叉（replication fork）可以選擇以複製叉反轉（fork reversal）或跨損傷DNA複製（translesion synthesis, TLS）這兩套機制來應對。複製叉反轉既產生反向複製叉結構，可在有複製壓力時保護停滯的複製叉避免其崩毀，也會使複製速度變慢；而跨損傷DNA複製則是在壓力下繞過或容忍DNA損傷繼續加速DNA的合成，過程中留下單股DNA（ssDNA）的間隙。為了了解複製叉怎麼選擇個別機制來應對複製壓力，來自哈佛醫學院的研究人員純化了與複製叉停滯後重啟時與新生成DNA作用的蛋白，再以質譜分析進行鑑定。除了鑑定到已知與複製叉相關的蛋白外，實驗中也發現 CARM1 也與複製叉的重啟相關 [1]。

CARM1 (coactivator-associated arginine methyltransferase-1) 也被稱為PRMT5，是蛋白質精氨酸甲基轉移酶的家族成員之一，主要的功能是催化蛋白質中精氨酸（Arginine）不對稱的甲基化（methylation）。這種蛋白質的轉譯後修飾（post-translational modification）在細胞中扮演各種角色，較常被探討的功能是在表觀遺傳學的基因表現調控——透過將組蛋白（histone）上的的第17、26、42號精氨酸甲基化（H3R17me, H3R26me, H3R42me）可促進基因轉錄 [2,3] 。

為了理解 CARM1 在複製叉的作用，他們接著以 siRNA 抑制 CARM1 在 MCF10A 乳癌細胞中的表現，再透過顯微鏡染色觀察複製叉活性。結果發現 CARM1 被抑制的細胞在固定時間內能產生更長的 DNA 纖維及生成更多的新複製叉，且複製叉的複製速度較快。在細胞重新表達 CARM1 時，不論是否是帶有甲基化酵素活性的版本都會使複製叉的複製速度變慢。這說明 CARM1 在複製叉有減速的作用，而失去 CARM1 會導致複製叉複製速度加速，且此作用與蛋白質甲基化無關。

二磷酸腺苷核糖基化酶（Poly ADP-ribose polymerase 1, PARP1）這個修復 DNA 單股斷裂（single-strand breaks）的修復酶被抑制時也會加速複製叉的複製速度 [4]。為了證明 CARM1 與 PARP1 是否在複製叉調控上有合作關係，作者使用了臨床上常用作癌症之標靶的 PARP1 抑制劑，發現 CARM1 被抑制的細胞，PARP1 抑制劑不會再使複製叉複製速度進一步加速，且減弱自發性的二磷酸腺苷核糖基化 （PARylation）。這說明在透過相同途徑下，CARM1 能促進 PARP1 在DNA複製時相關的功能。

在複製叉受到壓力且複製叉反轉因子缺乏的情況下，細胞則會使用跨損傷DNA複製，由DNA 引物酶 （primase）及DNA聚合酶 （polymerase）所構成的引物酶聚合酶複合物 （PrimePol）繼續複製 [5]。為了證明跨損傷DNA複製是當 CARM1 被抑制時複製叉加速的主因，他們在 CARM1 被抑制的細胞中同時抑制 RAD18 這個跨損傷DNA複製因子，複製叉速度減低了。失去 CARM1 的細胞增加了對壓力的耐受性，使細胞可以容忍DNA複製錯誤以面對DNA複製壓力。為了釐清 CARM1 與 PARP1 的交互作用，作者進一步以體外生化方法證明了 CARM1 的 PARP1 實際作用位點。實驗證實 PARP1 在與 CARM1 作用的情形下也會增強二磷酸腺苷核糖基化，而在缺乏 CARM1 的情況下 PARP1 亦不會有效地在複製叉進行二磷酸腺苷核糖基化。

這個研究顯示 CARM1 在複製叉速度控制及面對複製壓力時的機制抉擇所扮演的角色。在面對複製壓力時，CARM1 會透過活化 PARP1，產生有效的複製減速或停滯；在沒有 CARM1 或 PARP1 被抑制的情況下，複製叉則不能有效地減速，而會使用引物酶聚合酶複合物及跨損傷DNA複製繼續加速複製，從而增加單股DNA間隙及有絲分裂偏差（mitotic aberrations）的產生。透過探討 CARM1 在複製叉功能，將我們更了解下游 PARP 抑制劑作為標靶藥物的抗藥性機理。

參考文獻：

1. Marie-Michelle Genois et al. CARM1 regulates replication fork speed and stress response by stimulating PARP1. Molecular Cell (2021) https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.12.010
2. Uta-Maria Bauer et al. Methylation at arginine 17 of histone H3 is linked to gene activation. EMBO Report (2002) http://doi.org/10.1093/embo-reports/kvf013
3. Fabio Casadio et al. H3R42me2a is a histone modification with positive transcriptional effects (2013) https://doi.org/10.1073/pnas.1312925110
4. Apolinar Maya-Mendoza et al. High speed of fork progression induces DNA replication stress and genomic instability. Nature (2018) https://doi.org/10.1038/s41586-018-0261-5
5. Gongshi Bai et al. HLTF Promotes Fork Reversal, Limiting Replication Stress Resistance and Preventing Multiple Mechanisms of Unrestrained DNA Synthesis. Molecular Cell (2020) https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.04.031

撰文｜陳恩浩
審稿｜黃子瑄