Rif1與G-四聯體：DNA複製的時間管理者

DNA複製是細胞週期進行時極度重要的一環，DNA上所帶的遺傳訊息必須要被正確的複製才能維持細胞中基因體的穩定與完整性。由於 DNA 複製的重要性，其機制在演化上是具有高度保留性的。在真核生物的 DNA 複製系統中有多個複製起點，因此，真核生物中 DNA 複製起始必須被精準調控。且由於有多重複製起點的特色，真核生物的 DNA  複製是有時間順序的 ( replication timing program )。通常較早 DNA 複製的區域基因會較為密集 ( gene-rich domain ) ；而基因密度較低的區域 ( gene-poor domain ) 的複製通常會較晚發生，而其較晚複製的特徵可能與抑制性的表觀標記 ( repressive epigenetic marks ) 有關聯 [1]，因此複製時機 ( replication timing ) 顯得格外重要。其中 Rif1 蛋白扮演了重要角色。東京都醫學研究所正井久雄教授的研究團隊在2012年已指出 Rif1 可以調控整個基因組的複製時機，然而整個機制是如何調控的尚未明朗 [2]。 

為了闡明 Rif1 如何調控複製時機，研究團隊延續了上述研究並在經歷G1期到S期 ( G1/S boundary ) 的酵母菌中定序出90個潛在的 Rif1 結合區域 ( Rif1-binding sites，Rif1BSs ) [3]。團隊更深入探討後發現這些 Rif1BSs 多分佈於DNA複製較晚的區域或是休眠區域 ( dormant origin，註一 )。團隊一步分析後發現 Rif1BSs 中有共同序列 ( Rif1 consensus sequence ，Rif1CSs ) ，此外，有35個對 Rif1 親合力較高的 Rif1BSs 中通常包含兩個或兩個以上 Rif1CSs ，且這些 Rif1CSs 大多是鳥嘌呤 ( guanine ) 的重複序列 ( G-tracts )，更可能會形成較複雜的鳥嘌呤次級結構 (圖一)。

由於找到的 Rif1CSs 的分佈在 Rif1BSs 中並沒有規律性，作者們推測這些  Rif1BSs 可能會形成特定的結構。由於序列含有很多鳥嘌呤，作者假設 Rif1BSs 之間會形成鳥嘌呤四聯體 ( G-quadruplex， G4 ) 的次級結構，因此作者將兩段 Rif1BSs 純化出來並進行 DNA 電泳觀察，發現 DNA 出現偏移的條帶，顯示 DNA 可能形成某種次級結構導致移動速度變慢。因此團隊為了進一步證實這個次級結構是 G4 ，團隊加入 7-deazaguanosine 抑制胡斯坦鹼基配對 ( Hoogsteen pairing ) [註二]，證實原本 Rif1BSs 形成的偏移條帶在失去 Hoogsteen pairing 後就消失了，讓團隊更深信 Rif1BSs 會形成 G4 結構。

在 in vitro 的實驗中，團隊利用了可以穩定 G4 結構的配體 ( L1BOD-7OTD，telomestatin的衍生物 )，確認在35個 Rif1BSs 中有29個會採用 G4 結構，且Rif1會藉由辨識 G4 進而結合在 Rif1BSs 上。同時，作者們發現將 Rif1BSs 突變之後，會使原本較遠且較晚啟動複製的區域提早進行複製，( 約50kb外 )，顯示 Rif1 會大範圍抑制較晚進行複製的 DNA 區域。因此作者提出了 Rif1 可以大範圍抑制複製起始的模型 (圖二)。Rif1藉由棕櫚醯化 ( palmitoylation ) 附著在核膜上，並與數個較晚進行複製及休眠的DNA區域結合並產生高維的染色質結構，進而導致 DNA 複製被抑制 ( replication-suppressive chromatin architecture )。除此之外，Rif1 可以與去磷酸化酶 ( protein phosphatase 1，PP1 ) 結合，抑制周圍的複製起始位點鄰近的蛋白被磷酸化，進而抑制複製被啟動。

事實上，本篇研究找到的35個 Rif1BSs 中，有31個和先前在分裂酵母菌 ( fission yeast ) 中預測的 G4 motifs 不相同 [4]，說明 Rif1BSs 實際的結構還不確定。作者們對這樣的現象提出了解釋：作者推測形成 G4 結構所需的 Rif1CSs 數量不盡相同，單一個 Rif1CS 也許就能形成 G4 結構；抑或是需要兩個或兩個以上的 Rif1CSs 與 G tracts 參與 G4 的形成。因此團隊們認為他們未來的研究重點會放在 G4 的結構如何形成以及如何被精確調控，還有其在染色體上及在細胞中的生理功能，而這些成果都有助於學家們更了解 DNA 複製的過程以及染色體上的結構功能和動態變化。

註一：DNA上的休眠區域是指在一般情況下不會啟動複製的區域，但在遇到複製壓力導致複製暫停時，休眠區域會被活化，並幫助完成剩餘未完成的複製。
註二：胡斯坦鹼基配對是一種非典型的氫鍵 ( Hydrogen bond )，常出現於 DNA 鹼基的配對之間，而 G4 的形成正需要鳥嘌呤之間的胡斯坦鹼基配對。

參考文獻：
1. Göndör, A., Ohlsson, R. Replication timing and epigenetic reprogramming of gene expression: a two-way relationship?. Nat Rev Genet 10, 269–276 (2009). https://doi.org/10.1038/nrg2555
2. Yamazaki, S., Ishii, A., Kanoh, Y., Oda, M., Nishito, Y., & Masai, H. (2012). Rif1 regulates the replication timing domains on the human genome. The EMBO journal, 31(18), 3667-3677. https://doi.org/10.1038/emboj.2012.180
3. Kanoh, Y., Matsumoto, S., Fukatsu, R. et al. Rif1 binds to G quadruplexes and suppresses replication over long distances. Nat Struct Mol Biol 22, 889–897 (2015). https://doi.org/10.1038/nsmb.3102
4. Sabouri, N., Capra, J. A., & Zakian, V. A. (2014). The essential Schizosaccharomyces pombe Pfh1 DNA helicase promotes fork movement past G-quadruplex motifs to prevent DNA damage. BMC biology, 12(1), 1-14. https://doi.org/10.1186/s12915-014-0101-5

關鍵字：DNA 複製、 Rif1、 G-四聯體
撰文｜黃芝琳
審稿｜蕭皓文