小分子天然物可望為肝癌帶來一線曙光

以發病率與死亡率而言，肝臟惡性腫瘤（Hepatocellular carcinoma, HCC）是全球十大最常見的惡性腫瘤之一。許多致病因子，如B型肝炎病毒、C型肝炎病毒感染，甚至是暴露在黃麴毒素中，皆有可能造成惡性肝癌。肝癌病患的預後通常較差，前期的肝癌病患術後五年存活率僅25%-50%，根據SEER資料庫（Surveillance, epidemiology and end results database）顯示若癌細胞轉移到其他器官，五年存活率會降至5%以下 [1]。晚期肝癌細胞容易惡性轉移，因此科學家積極研究如何有效地抑制肝癌細胞移動能力，癌細胞爬行能力增強或是黏附能力減弱都能成為惡性轉移指標的一種，若能找到具潛力的治療藥物，了解藥物對動物體的影響機制，將會對緩解肝癌有很大的幫助。Genkwadaphnin （GD）是從芫花（Daphne genkwa）的花苞中分離出，芫花次級代謝物有類黃酮（Flavonoids）、木酚素（Lignan）以及雙萜（Diterpenes）等化合物，Genkwadaphnin則屬於雙萜類（Daphnane-type diterpenes）。 

延伸閱讀：癌症生物學 (Cancer Biology) 專題 (上)

本研究一開始指出，GD藥物能減少肝癌細胞的存活率，且能抑制細胞爬行與遷移能力。首先透過細胞群落形成試驗 [註一]，發現Hep3B與PLC/PRF/5 cells兩肝癌細胞株長時間存活能力隨著GD藥物給予濃度越高，癌細胞形成群落數能力越低。細胞癒合能力實驗 [註二] 分析，在GD藥物給予肝癌細胞株情況下，隨著濃度的增高，細胞癒合能力有顯著的下降。另一項侵襲能力實驗則可以透過癌細胞通過Matrigel與8 μm孔徑穿透至孔盤層貼附情形與對照組做比較，數據顯示在實驗組確實兩癌細胞株在孔盤下層貼盤細胞數顯著降低。 這些體外試驗的結果指出GD藥物能夠有效地抑制肝癌細胞的生長和遷徙。

為了進一步研究GD藥物影響肝癌細胞的機制，研究團隊透過Microarray、KEGG與GO線上資料庫分析GD藥物對肝癌細胞基因表現的影響，發現多種與代謝路徑相關之基因表現量有顯著改變，特別在48小時給予不同濃度GD藥物，DHCR24基因mRNA表現量隨著GD藥物濃度上升而有顯著下降。這些結果讓研究團隊深入研究DHCR24基因轉譯出的24-脫氫還原酶（24-Dehydrocholesterol reductase, DHCR24）對肝癌細胞的影響。

DHCR24酵素蛋白調控鏈甾醇（Desmosterol）轉化成膽固醇（Cholesterol），有研究已經證實此蛋白質與前列腺癌、卵巢癌和泌尿上皮癌症有極高度相關 [3]。DHCR24錯義突變（Missense mutation）造成的固醇類代謝紊亂，甚至會引起罕見體染色體隱性遺傳疾病（Desmosterolosis），伴隨著低表現的膽固醇及高表現的鏈甾醇濃度 [4]，且作者提及DHCR24酵素蛋白在肝臟中扮演重要的角色，肝臟合成體內近八成的膽固醇，代謝重整（Metabolic reprogramming）導致的膽固醇代謝異常近年已經在許多癌症惡化的進程中被證實。在2013年，Ming Lu等人的研究中提到，膽固醇乙醯轉移酶（Cholesterol acyltransferase）在肝癌細胞中高度表現，目的是降低氧化膽固醇（Oxysterols）對肝癌細胞本身的毒性，氧化膽固醇因是膽固醇氧化副產物，其毒性更甚於游離膽固醇，這樣的現象可避免肝癌細胞一死，促使癌細胞增生的可能 [5]。 另一方面，膽固醇是提供細胞膜合成與穩固的原料之一，倘若抑制DHCR24此酵素作用，會破壞脂膜筏（Lipid raft）[註三] 功能，且使上游的鏈甾醇累積，間接影響下游的訊息傳遞 [2]。

研究團隊透過轉染技術 [註四] 抑制DHCR24蛋白質表現量後，兩肝癌細胞株的膽固醇含量顯著降低 [圖一]，肝癌細胞存活率、爬行及侵襲能力皆下降，脂膜筏的結構也被破壞；團隊也透過轉染技術使肝癌細胞的DHCR24蛋白質過度表現，癌細胞中膽固醇表現量顯著上升，細胞爬行、侵襲能力也因DHCR24的活化而提升，在給予GD藥物後，DHCR24表現量下降伴隨著細胞遷徙能力有效地被抑制，結果顯示GD藥物透過抑制DHCR24蛋白調控膽固醇生合成路徑，進而影響肝癌細胞的生長及遷徙。在小鼠異種移植（Xenograft）試驗中，給予GD藥物後肝癌腫瘤的體積及重量明顯的降低，腫瘤組織中的細胞增生因子（Ki67）及腫瘤轉移因子（Vimintin、MMP2、MMP9）的表現量也被顯著抑制。肝癌細胞肺轉移的小鼠模型中，也可以觀察到小鼠肺部的瘤（Nodule）數量在給予GD藥物後明顯的減少。

肝癌細胞中DHCR24表現量顯著高於正常的肝細胞 [圖二]，且臨床的數據指出肝癌病人若有較高的DHCR24表現量，其存活率會低於DHCR24表現量低的病人。在臨床上是否已有藥物可影響膽固醇生合成？2020年Simonen等人發表在Journal of Internal Medicine期刊中提及，心律不整用藥胺碘酮（Amiodarone）可抑制DHCR24酵素活性，但這類藥品副作用多，因為累積過多鏈甾醇，可能對肝臟產生毒性，或是甲狀腺功能異常 [6]。本篇作者最後總結，研究的中草藥芫花萃取物–Genkwadaphnin透過DHCR24改變肝癌細胞的膽固醇生合成達到抑制肝腫瘤的增生及轉移，且對正常細胞有較低毒性，有望成為新的肝癌治療藥物，DHCR24蛋白對肝癌的影響不容小覷，但這些功效都需要更多進一步的實驗來證實。

註一：又稱Colony formation assay，將1000顆細胞種於格中，培養12天後，福馬林固定，結晶紫染色，計算50顆細胞以上的為一群落。

註二：又稱傷口癒合試驗，讓細胞長於盤中約九成滿時，用tip尖端畫出數道空隙，用顯微鏡觀察這些沒有細胞的區域在數個小時後的面積差別。

註三：指雙層磷脂質細胞膜上，載有特殊脂質與蛋白質的區域，如整合蛋白、鑲嵌有膽固醇、鞘磷脂的區域。

註四：外源DNA或RNA透過微脂體包覆，微脂體會與細胞膜上磷脂質重新構型，將外源物送入細胞內。因瞬間產生高量表達，又稱瞬間轉染（Transient transfection），通常只持續幾天。

 

參考文獻：

1. Huang, W., Yu, D., Wang, M., Han, Y., Lin, J., Wei, D., Cai, J., Li, B., Chen, P., & Zhang, X. (2020). ITGBL1 promotes cell migration and invasion through stimulating the TGF‐β signalling pathway in hepatocellular carcinoma. Cell Proliferation, 53(7). https://doi.org/10.1111/cpr.12836
2. Zerenturk, E. J., Sharpe, L. J., Ikonen, E., & Brown, A. J. (2013). Desmosterol and DHCR24: Unexpected new directions for a terminal step in cholesterol synthesis. Progress in Lipid Research, 52(4), 666-680. https://doi.org/10.1016/j.plipres.2013.09.002
3. Dai, M., Zhu, X., Liu, F., Xu, Q., Ge, Q., Jiang, S., Yang, X., Li, J., Wang, Y., Wu, Q., Ai, Z., Teng, Y., & Zhang, Z. (2017). Cholesterol Synthetase DHCR24 induced by insulin aggravates cancer invasion and progesterone resistance in endometrial carcinoma. Scientific Reports, 7(1). https://doi.org/10.1038/srep41404
4. FitzPatrick, D. R., Keeling, J. W., Evans, M. J., Kan, A. E., Bell, J. E., Porteous, M. E., Mills, K., Winter, R. M., & Clayton, P. T. (1998). Clinical phenotype of desmosterolosis. American Journal of Medical Genetics, 75(2), 145-152. https://doi.org/10.1002/(sici)1096-8628(19980113)75:2<145::aid-ajmg5>3.0.co;2-s
5. Lu, M., Hu, X., Li, Q., Xiong, Y., Hu, G., Xu, J., Zhao, X., Wei, X., Chang, C. C., Liu, Y., Nan, F., Li, J., Chang, T., Song, B., & Li, B. (2013). A specific cholesterol metabolic pathway is established in a subset of HCCs for tumor growth. Journal of Molecular Cell Biology, 5(6), 404-415. https://doi.org/10.1093/jmcb/mjt039
6. Simonen, P., Li, S., Chua, N. K., Lampi, A., Piironen, V., Lommi, J., Sinisalo, J., Brown, A. J., Ikonen, E., & Gylling, H. (2020). Amiodarone disrupts cholesterol biosynthesis pathway and causes accumulation of circulating desmosterol by inhibiting 24‐dehydrocholesterol reductase. Journal of Internal Medicine, 288(5), 560-569. https://doi.org/10.1111/joim.13095

撰文｜林潔芯
審稿｜張智婷