天然物 SPA 透過調節代謝抑制乳癌細胞增生

天然物及其結構類似物對於癌症與感染性疾病的藥物發現與治療，有著深遠的影響。據統計，近四十年來，抗癌天然物約佔新分子藥物的 15.4% [1]。一篇今年發表於 Nature Communications 的研究中 [2]，來自中國的研究團隊自天然物篩選抗癌藥物，發現土壤放線菌 Saccharopolyspora spinosa 所產生的多殺黴素（spinosad）中分離的天然物 spinosyn A（SPA），可以顯著地抑制癌細胞增生。多殺黴素可阻擾昆蟲中樞神經 GABA 受體之作用，並因其對哺乳動物較低的毒性、不具致癌性、與快速分解等特性，是許多殺蟲劑及  FDA 管理藥品的有效成分。

SPA 及其衍生物 LM-2I 能抑制癌細胞生長

首先團隊取用人類正常乳腺上皮細胞株與乳癌細胞株，測試 SPA 對細胞生長影響，發現 SPA 對於正常乳腺上皮細胞的生長僅有細微的影響，卻會顯著地抑制大部分乳癌細胞株的生長，且該抑制作用與劑量相關。進一步以合成的一系列 SPA 衍生物重複實驗，則發現其中 LM-2I 的抑制作用更甚於 SPA（圖一），且對於正常乳腺上皮細胞的毒性低。故後續以 SPA 與此衍生物 LM-2I 進行機制探討（圖二）。

為了解 SPA 與 LM-2I 抑制腫瘤生長的能力，團隊將三陰性乳癌細胞株 MDA-MB-231 由皮下注射至免疫缺陷的 BALB/c nu/nu 母鼠體內，在腫瘤初步形成時，進行藥物處理並觀察小鼠的腫瘤大小與體重變化。實驗發現相較控制組（注入藥物賦形劑）， SPA 與 LM-2I 皆能顯著地抑制異種移植（xenograft）的腫瘤生長，且不會造成小鼠體重大幅減輕，並以 LM-2I 效果較佳（圖三）。

SPA 及其衍生物 LM-2I 與精氨基琥珀酸合成酶（ASS1）結合

團隊接著想找出 SPA 與 LM-2I 在癌細胞中的作用標的為何，以 SPA 與 biotin（生物素）連接作為探針（probe），將之與乳癌細胞株的細胞裂解液共同培養，再以會與 biotin 形成穩定鍵結的鏈親和素（streptavidin，又譯卵白素）磁珠抓取探針，就能進一步純化分析與探針中 SPA 結合的蛋白質，最終，確認為精氨基琥珀酸合成酶（argininosuccinate synthase, ASS1），且在額外加入 LM-2I 的情況下，SPA 與 ASS1 的結合會減少，顯示 LM-2I 亦與 ASS1 作用。透過螢光染色，也在細胞質中偵測到 ASS1 與探針共存的訊號。這些實驗結果顯示，SPA 與 LM-2I 在癌細胞中的結合標的為 ASS1 。

SPA 與 ASS1 之間的交互作用是如何產生的呢？團隊由分子構效關係（structure-activity relationship），推測 SPA 中的 α,β-不飽和乙酮烯基（ketene）是麥可加成反應（註一）中的親核試劑接受者，可與標的蛋白質上的 Cys97 （cysteine，半胱胺酸）的硫醇官能基（thiol group）形成共價鍵結。此外也發現，若是 SPA 中 C13─C14 之間的雙鍵變為單鍵，會造成對 ASS1 的親和性顯著降低。

為了解析 SPA 與 ASS1 是否如預想的作用於 ASS1 的 cysteine，團隊將五個不同位點的 cysteine 置換為丙氨酸（alanine，Ala）或天門冬胺酸（aspartic acid，Asp），分析這些位點變異後是否造成 SPA 和 LM-2I 對 ASS1 的結合力改變。結果顯示當 Cys97 被置換為 Asp 時會喪失結合能力，另一方面，液相層析串聯質譜儀（LC-MS/MS）的分析中，由分子量的變化推得 SPA 與 LM-2I 與 ASS1 Cys97 位點確實形成了共價鍵結；以 LM-2I 與 ASS1 的結晶結構進行分子嵌合（molecular docking）模擬，也可見 LM-2I 的 C13 與 Cys97 形成了碳─硫共價鍵，並與 Asp182 與 Phe68 （Phenylalaine，苯丙胺酸）形成穩定的氫鍵（圖四）。

SPA 和 LM2I 提升 ASS1 酵素活性，抑制嘧啶生成、阻止癌細胞生長

那麼 ASS1 在乳癌中的生物功能又是什麼呢？ASS1 是廣泛存在於哺乳動物細胞中的一種酵素，負責催化天門冬胺酸（aspartic acid）與瓜胺酸（citrulline）合成精胺琥珀酸（argininosuccinic acid）的生化反應。先前研究已知，ASS1 的缺陷會引致一種名為瓜胺酸血症（citrullinemia）的體染色體隱性尿素代謝疾病 [3]，在許多癌症中也觀察到 ASS1 發生體細胞突變或是表現量降低的現象，然而 ASS1 在癌症進程所扮演的角色仍未明朗 [4]，因此研究團隊也針對 ASS1 進行一系列機制研究，ASS1 是如何抑制癌細胞增生 。

首先團隊透過將 ASS1 與不同濃度的 SPA 或 LM-2I 共同培養後，再加入其受質測試 ASS1 酵素活性，發現 SPA 與 LM-2I 皆會促進 ASS1 的酵素活性，隨著藥物濃度提高影響漸增，但也觀察到逐步飽和的現象，其中又以 LM-2I 作用較強。

然而不同乳癌細胞株中 ASS1 表現量不一，團隊於是採用低表現的 MDA-MB-231 與高表現的 MCF-7 細胞株，分別進行 ASS1 的過表現與表現量降低（knock-down），觀察癌細胞生長變化。實驗發現過量表現 ASS1 的 MDA-MB-231 ，細胞增生速率減緩，而降低了 ASS1 表現量的 MCF-7 ，則加速增生。ASS1 的過表現也顯著抑制了 MDA-MB-231 異種移植的腫瘤生長。由臨床樣本進行免疫組織染色分析，發現 ASS1 表現量較低的患者，預後較不佳，且復發率較高。這些結果意味著 ASS1 在乳癌中可能作為抑癌基因，而由 CRISPR/Cas9 的基因敲除系統也驗證了 SPA 與 LM-2I 是透過與 ASS1 進行交互作用，而達到抑制癌細胞增生的效果。

至於 ASS1 抑制癌症的機制則或許與代謝相關，先前研究曾指出 ASS1 活性降低會增進癌細胞代謝物產生，促進癌細胞增生。團隊透過液相層析質譜儀分析，發現 SPA 或 LM-2I 會降低癌細胞中天門冬胺酸 （aspartic acid），而 CMP、UMP、與 TMP 等腺苷的含量亦降低。若於培養基中額外加入嘧啶，則能恢復癌細胞的存活情形，然而加入嘌呤則無此效果。故研究推論 SPA 與LM-2I 是藉由活化 ASS1 達到抑制嘧啶生成，進而能抑制癌細胞生長。

這項研究由天然物篩選出了可能的抗癌小分子 SPA 與其衍生物 LM-2I，並透過生化與遺傳分析，鑑測其作用標的、探討作用機制。這也提供了癌症治療的另一個思考方向：過往在缺乏 ASS1 或 ASS1 靜默的癌細胞中，由於細胞無法自行合成、需仰賴外源精氨酸（arginine）才能存活。在治療上常利用這項代謝缺陷，剝奪環境中的精氨酸，使癌細胞營養缺乏而死，然而這項治療遭遇的困境便是 ASS1 再度表現所造成的抗性。而本研究發現 SPA 和 LM-2I 透過更進一步提升 ASS1 活性進而抑癌的作用，或許能作為一新治療手段。

註一、麥可加成反應（Michael reaction）是親核試劑對 α,β-不飽和羰基化合物在 β 位碳原子發生的共軛加成反應。

參考文獻：

1. Newman, D. J., &Cragg, G. M. (2020). Natural Products as Sources of New Drugs over the Nearly Four Decades from 01/1981 to 09/2019. Journal of Natural Products, 83(3), 770–803. https://doi.org/10.1021/acs.jnatprod.9b01285
2. Zou, Z., Hu, X., Luo, T., Ming, Z., Chen, X., Xia, L., …Luo, Z. (2021). Naturally-occurring spinosyn A and its derivatives function as argininosuccinate synthase activator and tumor inhibitor. Nature Communications, 12(1), 2263. https://doi.org/10.1038/s41467-021-22235-8
3. Woo, H. I., Park, H.-D., &Lee, Y.-W. (2014). Molecular genetics of citrullinemia types I and II. Clinica Chimica Acta, 431, 1–8. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.cca.2014.01.032
4. Rabinovich, S., Adler, L., Yizhak, K., Sarver, A., Silberman, A., Agron, S., …Erez, A. (2015). Diversion of aspartate in ASS1-deficient tumours fosters de novo pyrimidine synthesis. Nature, 527(7578), 379–383. https://doi.org/10.1038/nature15529

關鍵字：spinosyn A, LM-2I, argininosuccinate synthase

撰文｜陳品萱
審稿｜黃云宣