分子模擬篩選出有望抑制 SARS-CoV-2 病毒複製的海洋天然物

造成全球大流行的 SARS-CoV-2 屬於冠狀病毒科的單股 RNA 病毒，其藉由棘蛋白（spike protein）進入宿主細胞後，會由轉譯開啟病毒的複製週期，首先基因組轉譯出兩條多聚蛋白，接著 3CL 蛋白酶（3C-like protease, 3CL^Pro）和 PL 蛋白酶（papain-like protease, PL^Pro）負責將轉譯出的病毒多聚蛋白切割，以產生後續病毒複製所需的各種蛋白質，其中也包括催化病毒 RNA 合成的 RdRp（viral RNA-dependent RNA polymerase，RNA 依賴型 RNA 聚合酶）。

儘管某些抗 SARS-CoV-2 藥物已進入臨床試驗，如 Lopinavir、Ritonavir、Remdesivir、Umifenovir、Favipiravir，但用於 COVID-19 病人上也仍發現可能有嚴重副作用 [1]。此外，有些團隊試著從天然物中找尋可能的化合物 [2]，然而海洋天然物卻是一個尚未被深入探索的來源。眾多研究都指出某些海洋化學小分子，包括聚酮（polyketides）、萜烯（terpenes）、含氮化合物及多醣類等具有抗細菌、抗真菌或抗病毒活性 [3]。因此，南韓研究團隊設計出模擬篩選系統（圖一），在海洋天然物資料庫（註一）中進行篩選，以上述三個 SARS-CoV-2 重要蛋白質 3CLPro、PLPro 和 RdRp 為標靶，並採已知抑制劑或現有藥物作為參考化合物（表一），找出表現較好、具藥用潛力的小分子 [4]。

圖一、本篇研究篩選方法示意圖。（圖片來源：doi.org/10.3389/fmicb.2021.647295）

表一、本研究各標靶蛋白所採之 PDB 結構及參考化合物

標靶病毒蛋白	蛋白質結構PDB ID	參考化合物（Reference compound, REF）
3CL^pro	6Y2F	α-ketoamide 抑制劑13b
PL^pro	6WX4	抑制劑VIR251
RdRp	6M71	Remdesivir

整體的篩選過程包括以下五個階段：

初步篩選
利用 Lipinski 五規則（註二）和 ADMET（註三）性質從 14,492 個海洋天然物中篩選出 2,033 個具有藥物性質的化合物。
分子嵌合（molecular docking）
以前一階段得到的候選化合物，加上另兩種臨床試驗中的化合物 Lopinavir 及 Ritonavir ，運用 GOLD 軟體 [5] 模擬各化合物和對應蛋白質的交互作用，並計算 Goldscore 和 Chemscore 。 Goldscore 代表化合物與蛋白質的結合傾向，而 Chemscore 則計算整體結合自由能，因此 Goldscore 越大、Chemscore 越小表示該候選化合物與目標蛋白的結合潛力越好。以參考化合物（REF）為基準，團隊篩選出 Goldscore 大於且 Chemscore 小於參考化合物的候選化合物，並從中挑出能和目標蛋白（3CL^Pro、PL^Pro和RdRp）中重要氨基酸形成適當氫鍵的 14 個化合物。
分子動態模擬（molecular dynamics simulation）分析（圖二）
運用 GROMACS 模擬工具對上個階段得到的 14 種化合物進行 30 奈秒的生產過程（production run）分析，能得到眾多嵌合構型間的均方根偏差（Root Mean Square Deviation, RMSD），得知特定模擬構型的穩定度，RMSD 較小、代表嵌合構型相對穩定。另外，利用 MM/PBSA 方法計算結合自由能（binding free energy, BFE），則可以評估化合物與蛋白質之間的結合力，自由能越小結合力越強。此階段針對三種蛋白質各篩選出兩種化合物 Hit1 及 Hit2，較參考化合物都具有更高的親合力。值得一提的是，Lopinavir 及 Ritonavir 與 3CL^Pro、PL^Pro的結合雖然優於與這兩個蛋白共結晶的抑制劑 13b 和 VIR251，但較團隊篩選出的 Hit1、Hit2 差，顯見本研究模擬篩選得的化合物或許有更好的適用潛力。

圖二、分子嵌合及分子動態模擬分析結果（圖片來源：doi.org/10.3389/fmicb.2021.647295）
結合模式和分子交互作用分析
根據整個模擬過程最後10奈秒的平均結構，進一步探討兩個最終篩選化合物與對應蛋白質的詳細分子間交互作用情形，如有氫鍵、疏水性作用力等代表結合較穩固。分析結果顯示本篇針對 3CL^Pro、PL^Pro 和 RdRp 三種蛋白質選出的兩個化合物雖然和參考化合物與蛋白質間形成的氫鍵位置及數量不同，但卻都能和各蛋白質催化區域的重要氨基酸產生特定的作用力。例如，針對 3CL^Pro選出的兩個化合物皆和蛋白質催化三連體（catalytic triad）的 His41、Cys145、Glu166 間有氫鍵或疏水性作用力，且較 Lopinavir 及 Ritonavir 和 3CLPro 之間形成的氫鍵數量更多（圖三）。而針對 PL^Pro選出的兩個化合物則是和催化中心重要氨基酸 Asp164、Tyr268 間能形成氫鍵。

圖三、參考化合物、Hit1、Hit2 與 SARS-CoV-2 3CLPro 的結合。上半為 3D 立體結構，下半為 2D 平面圖示與各氨基酸的交互作用。（圖片來源：doi.org/10.3389/fmicb.2021.647295）
電腦模擬預測候選化合物的藥物動力學性質
利用線上的機器學習平台 pkCSM 分析先前得到的 6 種化合物（圖四）之 ADMET 性質，並將分析結果與各自的參考化合物比較，發現針對 3CL^Pro之 Hit1、針對 PLPro 之 Hit1 和針對 RdRp 之 Hit2 顯現優越的藥物動力學性質。

本研究從海洋天然物資料庫中，利用分子嵌合和配體與蛋白質間詳細的交互作用力探討，搭配分析藥物動力學的機器學習演算法，篩選出針對 SARS-CoV-2 的三個病毒複製關鍵蛋白質3CL^Pro、PL^Pro 和RdRp，各兩個具有潛力的候選抑制劑，提供了 COVID-19 藥物發展一些新的可能性。

圖四、候選化合物之分子結構與自然界來源。（圖片來源：doi.org/10.3389/fmicb.2021.647295）

註一、本篇使用的海洋天然物資料庫來源：http://docking.umh.es/downloaddb

註二、Lipinski 五規則包括化合物的分子量小於 500 道爾頓、結構中的氫鍵給體數量少於 5 個、氫鍵受體數量少於 10 個、脂水分配係數的對數值（logP）在– 2 到 5 之間以及可旋轉鍵的數量少於 10 個。符合此規則的化合物理論上具有較好的藥物動力學性質，更高的生物利用度，有較高的機會成為口服藥物。

註三、ADMET 藥物動力學性質包括吸收、分佈、代謝、排泄、毒性。