CRISPR 基因與基因體學

RNA 追追追 – 利用 CRISPR/Cas9 精準定位活細胞 RNA

細胞 DNA 上所編碼的基因活化後經過轉錄,製造出初始 RNA 再經過一連串的選擇性剪接和修飾,運輸到細胞內專職的區域進行轉譯,合成具有特定功能的多肽鏈,這是我們再熟悉不過的中心法則 (central dogma)。在許多疾病如癌症或是傳染病中像是 H1N1 流感病毒 (influenza virus) 核酸的複製與包裝,若是能知道 RNA 在細胞中的位置,就能有效地協助我們釐清疾病的致病機轉、細胞如何分化,或是藉由定位 (localization) 來探討 non-coding RNA 於細胞中的作用。

分子生物學技術日益發達,我們有很多方法能夠直接從細胞基因體 DNA 進行修改,影響基因的表現,然而要針對 RNA 進行操作就不是件容易的事了,我們雖然有很多方法可以抑制 RNA 轉譯,如:利用小片段的干擾 RNA(Small interference/siRNA)或 Antisense 的寡核苷酸鏈(Oligonucleotides),但是舉凡其他轉錄後修飾(Post-translational modification)像是 RNA 在細胞內的運輸(Trafficking)、選擇性剪切 (Alternative splicing)、多聚腺苷酸化(Polyadenylation)和轉譯的空間時間等,我們都難以直接在活細胞中親眼看到這一連串的過程。由於種種需克服的難題,定位活體細胞內 RNA 位置的就顯得非常重要,能知道 RNA 的位置我們就能知道 RNA 被轉錄出來後,從送出細胞核到被轉譯成多肽鏈這一漫長旅程究竟發生了那些事。過去所應用之辨識及定位 RNA 的方法多著重於以基因工程製造具有 RNA-binding domain 的蛋白,例如:Pumilio and FBF homology (PUF) 蛋白由含有 36 個胺基酸且 8 重複的多肽鏈構成,能逐一辨識 8 個 RNA 鹼基,若將 PUF 帶上特殊酵素的功能或螢光,我們就能對 RNA 進行操作(Manipulation)或定位。其他方法還包括了分子信標(Molecular beacon)或 RNA 適體(RNA aptamer)等二十世紀末被開發出來的技術,這些技術都有一些使用上的限制如只能用於影像定位不能操控或是會影響到 RNA 的表現與轉譯。

CRISPR/Cas9 系統的出現革新了 RNA 視覺化(RNA imaging)與定位技術,克服了上述其他技術的一些缺點,雖然 CRISPR/Cas9 最初作用的目標物是有編碼的 DNA(Encoding DNA),不過於 2014 年已有其他研究提出能使 CRISPR/Cas9 辨識 RNA的方法,可藉由讓帶有 PAM(Protospacer adjacent motif)的寡核苷酸鏈與 RNA 雜合(Hybridization),而 Cas9 蛋白靠著導引 RNA(Single-guide RNA)會辨識到 PAM ,因此我們就能讓 Cas9 結合到我們感興趣的 RNA 上。而在這篇研究中,為了讓活細胞中的 RNA 視覺化並定位,作者使用失活核酸酶(dCas9)的功能並帶上綠色螢光蛋白(合稱為 dCas9-GFP),將這些技術綜合起來,我們就能在螢光顯微鏡下直接觀察到 RNA 隨著時間演進,在細胞內空間的變化,不管是 RNA 的運輸、受到氧化壓力時 RNA 表現位置的改變、堆聚到壓力囊泡(Stress granule)中等,都在這項研究中得到驗證。作者利 RNA 螢光標記的核酸探針,佐證了利用 CRISPR/Cas9 定位活細胞 RNA 的可行性,有了這項技術以後,未來我們研究感興趣基因的表現時,不再只是知道表現量上升或下降,我們可以更清楚的知道細胞受到外來因子刺激後,RNA 被製造後在細胞內各區域之間運輸的即時動態影像。

研究團隊利用 dCas9-GFP 加上帶有 PAM 寡核苷酸的設計,成功達成辨識 RNA 的結果。(圖片來源:https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(16)30204-5)

參考資料:

  1. Fan, C. (2016). Faculty of 1000 evaluation for Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell, 165(2), 488-496 doi: 10.3410/f.726227831.793517509

撰文│ 姚京含
修訂│ 蔡京庭

 

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姚京含

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大家好,我是 京含,目前在台中的中國醫藥大學擔任 Intern。