靶向蛋白質降解（targeted protein degradation）是目前藥物開發的新興方向。有別於傳統小分子藥物一般以抑制蛋白質活性為目標，靶向蛋白質降解則利用了細胞天生內建的蛋白質泛素化（ubiqutination）降解系統，以引導目標蛋白質接近 E3 泛素連結酶（E3 ubiquitin ligese）後被蛋白酶體（proteasome）降解來清除致病蛋白。這為先前活性無法被小分子抑制而無藥可用的治療標的打開了研發新路。其中，蛋白水解靶向嵌合體（proteolysis targeting chimeras, PROTACs）及分子膠水（molecular glue）在誘導蛋白質目標接近 E3 泛素連結酶中扮演了重要角色（圖一）。
圖一、分子膠水與 PROTAC 的示意圖。圖片來源：https://www.protein-degradation.org/wp/wp-content/uploads/2020/04/Winter_Figure1.png
分子膠水是一類單價（monovalent）小分子，它們本身對降解的目標蛋白一般沒有可測量的親和力，然而卻可以通過在結合界面附近誘導幾種蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction）來協調連接酶和目標蛋白之間的辨識，透過重塑 E3 泛素連結酶與目標蛋白質受體的接觸表面，促進目標蛋白質與泛素連結酶複合體接近，使之被泛素化。與同屬靶向蛋白質降解分子的蛋白水解靶向嵌合體不同，人工設計的PROTAC 分子是以能與目標蛋白質結合的配體（ligand）加上能與E3泛素連結酶的配體與連接（linker）結合而成。PROTAC 分子這樣的雙價（bivalent）分子的優點是能夠對配體已知的知識去進行合理的設計，但 PROTAC 亦因較複雜的組成有較大的分子量，藥物動力性質差，因此藥物研發的可行性較低。反之分子膠水在結構上則沒有這樣複雜的組成，其較小的分子量，在性質上更符合藥物動力學（圖二）。然而，我們對單價的分子膠水如何成為降解劑的學理難以預測，特定目標的分子膠水的發現往往是偶然的發現，無法像 PROTAC 能輕易地針對目標進行設計。例如：早在還不知道分子膠水的概念存在已先，在藥物研發中已偶然地發現從微生物提取的環孢素A（cyclosporin A）及 FK506 具有免疫調節活性，被用於控制器官移植的排斥上，而一直到美國食品及藥物管理局（FDA）核准上市8年後其分子膠水的作用機轉才被發現。
圖二、GSPT1 分子膠水及 MDM2 PROTAC 的化學結構。 圖片來源：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202004310
為了發現更多分子膠水作為藥物研發的候選者，維也納分子醫學研究中心（CeMM）的科學家透過高通量化學篩選（chemical screening）比較 cullin-RING E3 泛素連接酶（cullin-RING E3 ligases, CRL） 的類泛素化作用 （neddylation）正常及被抑制的UBE2M 基因（註一）突變細胞株在約 2000 種具細胞生長抑制或毒性的化合物下的增殖狀況。假設一個化合物在需要 CRL 的作用才會抑制或毒殺細胞的話，那它就有可能是潛在的分子膠水。透過高通量化學篩選，他們發現4個分子膠水候選物（圖三）。為了驗證這4個分子膠水的蛋白質標的，他們透過蛋白質體（proteomics）偵測各個蛋白在分子膠水下的含量的變化，發現了其中 dCeMM1 的所降解的目標蛋白是 RBM39 RNA 結合蛋白，另外 3 個分子膠水（dCeMM2、dCeMM3 和 dCeMM4）的降解的則是 CDK12 及 Cyclin K 週期素蛋白。
圖三、4個分子膠水候選物的化學結構。 圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41589-020-0594-x
為更進一步了解這些分子膠水的作用機理，他們使用 CRISPR 進行抗性篩選（resistant screening），運用針對不同基因的引導 RNA（sgRNA）去個別針對性地剔除基因，之後施加相關化合物，最後則可透過高通量定序檢測針對不同引導 RNA 的表達量，在相關基因被剔除而獲得對分子膠水抗性的細胞會存活，因而該引導 RNA 量會增加，故可推敲該基因與分子膠水作用的相關性。通過 CRISPR 篩選出分子膠水作用所需的基因，他們發現 dCeMM2、dCeMM3 和 dCeMM4 這 3 個 CDK12 及 Cyclin K 週期素蛋白降解劑有別於以前發現的分子膠水，並未需要底物受體（substrate receptor）就可作用。進一步的生化實驗證明這3個分子膠水可透過與 CDK12-Cyclin K 週期素蛋白複合物結合，穩定複合物與 CRL 接受蛋白 DDB1 的作用，從而造成 Cyclin K 週期素蛋白的降解。
透過結合高通量化學篩選、蛋白質體學、CRISPR 基因功能抗性篩選等方法學，他們演示了大規模蒐集新分子膠水降解劑可行性。期待更多分子膠水被發現並成為未來小分子藥物研發的生力軍，讓更多不治之症成為過去式。
註一：UBE2M 基因是負責編碼出類泛素化作用中的 E2 連結酶
參考文獻：
1. Schreiber, S. The Rise of Molecular Glues. Cell. (2021) https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.020
2. Mayor-Ruiz, C., Bauer, S., Brand, M. et al. Rational discovery of molecular glue degraders via scalable chemical profiling. Nat Chem Biol 16, 1199–1207 (2020). https://doi.org/10.1038/s41589-020-0594-x
撰文｜陳恩浩
審稿｜林書岑
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