認識類鼻疽與致命的神經性類鼻疽的重要性
2005 年襲台的強颱海棠帶來的不只是嚴重水患，也帶來了經常伴隨著風災後發生的類鼻疽（melioidosis）疫情，合計通報了 24 例，其中 6 例死亡，2 例進入重症加護病房 [1]，死亡率高達 25%。類鼻疽的主要致病菌是類鼻疽伯克氏菌（Burkholderia pseudomallei），其超耐乾熱的特性使其能在泥土、水中或動物糞便中生存幾個月或幾年，當大水過後因環境髒亂就容易引發伺機性感染。
類鼻疽（註一）較為致命的情況是生物吸入帶有致病菌的塵土到肺部時，造成肺部膿瘍，出現肺炎症狀，並可能出現急性血行感染（acute bloodstream infection），導致敗血性休克，或發生少見但致命的神經性類鼻疽，其中以腦膜炎最常見 [2]。值得一提的是這個菌種本質上對許多抗生素有抗性，從過去到現在一直都是公衛或社區醫學領域備受關注的議題（圖一）。
圖一、全國類鼻疽本土病例及境外移入病例確定病例同期比較趨勢。
圖片來源：衛生福利部疾病管制署（2021）https://www.cdc.gov.tw/Disease/SubIndex/WGBQSsyqfj6SiFQ4aMXXUg
關於神經性類鼻疽，過去的文獻指出小鼠被誘發類鼻疽症狀時，類鼻疽伯克氏菌會包藏在帶有選滯蛋白（selectin）的 CD11b+ Ly6c 單核球（註二）中，像是藏在木馬內的敵軍一樣穿越腦部內皮細胞移動到腦膜內 [3]。於此同時類鼻疽伯克氏菌也會大量出現在血液中，且其所產生的脂多醣（lipopolysaccharide, LPS）進一步造成內毒血症（endotoxemia）或敗血症，誘發腦部血管的內皮細胞或神經膠細胞（glial cells）過度分泌血管擴張因子與發炎因子，使血腦障壁的結構受到破壞 [4]。但這些結果仍無法清楚說明入侵腦部、引發神經性類鼻疽的主因，究竟是藏在 CD11+ Ly6c 單核球的菌體，還是游離在血液中的菌體。
一直致力於研究伯克氏菌屬的陳亞雷教授與其團隊，曾發現與其他同屬菌種相比，B. multivorans NKI379 所產生的 LPS 能誘發最多的血清發炎因子，他們依據這個結果進一步推論，如果類鼻疽伯克氏菌是靠著 Ly6c 單核球當作木馬入侵到腦部，那麼將帶有類鼻疽伯克氏菌的單核球注入到受 B. multivorans NKI379 LPS 感染的小鼠血管中，應能觀察到比單純注入游離的類鼻疽伯克氏菌的小鼠，有更高的機會出現神經性類鼻疽的現象，同時應能看到血腦障壁有更明顯的受損 [5]。因此本篇研究主要想回答兩個問題：
- B. multivorans NKI379 的 LPS 是否與其他同屬菌種相比，對腦部發炎因子的濃度以及血腦障壁完整性有最顯著的影響？
- 在已受到伯克氏菌屬（Burkholderia）的 LPS 感染而產生內毒血症的小鼠中，是搭載著 Ly6c 單核球還是游離在血液中的類鼻疽伯克氏菌，能夠產生較多的腦內菌數以及嗜中性球浸潤的狀況（嗜中性球浸潤程度高代表外來物入侵多）？
註一、類鼻疽伯克氏菌另外一個常見的感染途徑是在接觸到被汙染的泥土或汙水時，經由皮膚傷口進入。常見症狀有局部皮膚紅疹潰爛，多數器官的急性或慢性膿瘍，例如關節、淋巴、肝和脾等。慢性病，例如糖尿病、高血壓、癌症、心臟病或免疫疾病等，都是致病的危險因子。前述提到 2005 年確診的 24 例病人中有 20 位有部分的致病因子。 2007 年被衛福部疾病管制署列為第四類法定傳播疾病。
註二、選滯蛋白（selectin）是內皮細胞（endothelial cells）和白血球的表面蛋白，幫助細胞附著與移動，與其他細胞附著因子共同調控白血球進入腦膜（meninges） [6]。
確認 B. multivorans 產生的 LPS 誘發最顯著的腦部發炎反應與血腦障壁受損
先前的研究提到 B. mutlivorans 的 LPS 誘發了最多的血清發炎因子表現，但針對遠端腦部的影響還需進一步的研究，因此本篇研究將不同的伯克氏菌種（ B. pseudomallei, B. thailandensis, B. cenocepacia 與 B. mutlivorans）的 LPS 透過皮下注射感染小鼠 24 或 48 小時之後，測量其腦部組織的細胞激素（cytokine）、趨化因子（chemokine）與細胞附著分子（cell adhesion molecules, CAMs）的量；另外也觀察了神經膠細胞與內皮細胞的數量變化，發現 B. multivorans 的 LPS 確實產生了較多的細胞激素與神經膠細胞的活化，顯示其誘發腦部發炎反應的程度在同屬的伯克氏菌中是最強的（圖二）。
圖二、大腦細胞激素、趨化因子以及細胞黏著分子的表現量。整體來說誘發發炎因子的強度排序為：B. multivorans LPS -> B. pseudomallei LPS = B. cenocepacia LPS -> B. thailandensis LPS -> PBS 。
圖片來源：doi:10.1038/s41598-018-31778-8
至於 LPS 對血腦障壁完整性的影響，作者首先利用免疫染色（immunohistochemistry, IHC）的技術，觀察 CD34 在被不同菌種 LPS 感染的小鼠的腦部表現量。前述提到主要夾帶 B. pseudomallei 的單核球具有選滯蛋白（selectin）表現，而此處觀察的 CD34 是位在內皮細胞表面與選滯蛋白互補的分子，參與了白血球穿越血管內皮細胞的運動。從結果來看，發現 B. multivorans LPS 組別有最高的 CD34 表現量，推論受該菌種的 LPS 感染的小鼠白血球穿透血管內皮的活動較為旺盛。進一步使用 Evan’s Blue 染色觀察血腦障壁的完整度，由於該染劑與血清白蛋白有很高的親和度，結構正常的血腦障壁無法使白蛋白穿越，因此若結構出現異常或完整性受到破壞的話，就會看到如圖三（a）一樣的深染現象（此處定義為 Level 1）。從圖三可以看到受 B. multivorans LPS 感染的小鼠腦部是唯一有 Level 1 現象的組別，測量浸潤到腦部的白血球數量（brain-infiltrating leukocytes, BILs）也取得了一致的結果（圖三）。
圖三、血管通透度與腦部浸潤白血球（brain-infiltrating leukocytes）分析。
圖片來源：doi:10.1038/s41598-018-31778-8
夾帶 B. pseudomallei 的 Ly6c 單核球入侵是造成腦部發炎的主要路徑
為了探討在內毒血症期間，透過 Ly6c 單核球當作木馬入侵腦部是否為類鼻疽腦炎的主要致病機轉，作者從已被誘發內毒血症的小鼠尾巴，透過靜脈分別注射游離的菌與帶有菌的單核球到小鼠體內，分析小鼠腦部組織切片後發現只有注射了帶有菌的單核球才有造成腦內的細菌量上升，同時也看到在受到不同伯克氏菌種 LPS 感染的小鼠上都有出現大量嗜中性球浸潤的現象，顯示 B. pseudomallei 主要透過包藏在 Ly6c 單核球入侵造成腦部發炎（圖四）。
圖四、比較注入游離的菌與帶有菌的單核球對腦部細菌數量以及浸潤在腦膜的嗜中性球數量。
圖片來源：doi:10.1038/s41598-018-31778-8
結論
大腦平時受到血腦障壁嚴密的保護，因此一旦有能夠瓦解鐵壁的病原體入侵的時候，後果都相當嚴重。李斯特菌（Listeria monocytogenes）與結核分支桿菌（Mycobaterium tuberculosis）都曾被發現利用帶有細胞附著蛋白的白血球入侵腦部的情況 [7]。本篇研究是第一次透過動物實驗揭示，於敗血性或內毒性類鼻疽感染中，有相似的木馬入侵中央神經的機制，對於臨床和科學界有相當重大的貢獻。
圖五、風災後的伺機性感染菌──類鼻疽伯克氏菌。圖片來源：1. Photo by Courtesy of Larry Stauffer, Oregon State Public Health Laboratory, USCDCP, Pixnio 2. 柯金源; 難以抹滅的風雨記憶：五個臺灣史上的颱風之最；HOME RUN TAIWAN
參考文獻
- 「7/18海棠颱風過後引發之類鼻疽疫情，危機解除」；衛生福利部疾病管制署新聞稿 (2005-08-09)；https://www.cdc.gov.tw/Bulletin/Detail/oSuPcDSimjZkan_GxUvCcA?typeid=9
- Wiersinga, W., van der Poll, T., White, N. et al. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat Rev Microbiol 4, 272–282 (2006). https://doi.org/10.1038/nrmicro1385
- Liu, Pei-Ju, et al. Induction of mouse melioidosis with meningitis by CD11b+ phagocytic cells harboring intracellular B. pseudomallei as a Trojan horse. PLoS neglected tropical diseases 7.8 (2013): e2363. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002363
- Banks, William A., and Sandra M. Robinson. “Minimal penetration of lipopolysaccharide across the murine blood–brain barrier.” Brain, behavior, and immunity 24.1 (2010): 102-109. https://doi.org/10.1016/j.bbi.2009.09.001
- Hsueh, PT., Lin, HH., Liu, CL. et al. Burkholderia pseudomallei-loaded cells act as a Trojan horse to invade the brain during endotoxemia. Sci Rep 8, 13632 (2018). https://doi.org/10.1038/s41598-018-31778-8
- Engelhardt, Britta. “Immune cell entry into the central nervous system: involvement of adhesion molecules and chemokines.” Journal of the neurological sciences 274.1-2 (2008): 23-26. https://doi.org/10.1016/j.jns.2008.05.019
- Dando, Samantha J., et al. “Pathogens penetrating the central nervous system: infection pathways and the cellular and molecular mechanisms of invasion.” Clinical microbiology reviews 27.4 (2014): 691-726. https://doi.org/10.1128/CMR.00118-13
撰文｜黃玟瑜
審稿｜陳品萱、黃云宣、黃文彥
