結核病（tuberculosis, TB）最早是在 1882 年由德國醫師兼微生物學家柯霍（Koch）發現，其致病菌是結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）。根據世界衛生組織（World Health Organization, WHO）統計，在 2020 年全球估計有 1000 萬人感染肺結核。感染者中因不當使用抗結核藥物，產生耐藥性結核病（multidrug-resistant TB, MDR TB）。耐藥性結核病對異煙肼（isoniazid, INH）和利福平（rifampicin, Rif）這兩種目前最有效的第一線抗結核病藥物有抗藥性，若要進一步治療則需使用昂貴且有毒的第二線藥物；倘若連第二線藥物都產生抗藥性，將會沒有進一步治療的選擇 [1]。
目前已知生物膜（biofilms）的形成會使病原菌（pathogenic bacteria）獲得能躲避宿主免疫系統、產生抗藥性和重複發生感染的能力 [2]。生物膜形成分成四個步驟：
1. 細菌先附著在生物或非生物表面
2. 發展為不可逆附著，此時細菌會產生胞外聚合物（extracellular polymeric substance, EPS），參與生物膜的形成
3. 附著的細菌作為菌落不斷生長與繁殖，形成成熟的菌落群
4. 最後通過生物膜擴散，尋找新的附著環境（圖一）[3]。
Ashwani Kumar 團隊在先前的研究中已知結核分枝桿菌會在生物體外會形成含有纖維素（cellulose）成分的生物膜，然而結核分枝桿菌缺乏合成纖維素的纖維素合成酶（cellulose synthase）。他們推測可能結核分枝桿菌是透過非典型纖維素生合成（non-canonical cellulose biosynthesis）的方式來製造纖維素 [4]。先前實驗只確定結核分枝桿菌會在生物體外形成生物膜。因此 Ashwani Kumar 團隊此次研究探討結核分枝桿菌在感染的生物體內是否也會形成生物膜 [5]。
圖一、生物膜形成流程圖。圖片來源：https://doi.org/10.1128/CMR.00084-16
首先，Ashwani Kumar 團隊先分析三種非結核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria, NTM）是否會生成生物膜。研究使用膿腫分枝桿菌（Mycobacterium abscessus, Mab）、偶然分枝桿菌（Mycobacterium fortuitum, Mfo）和鳥型分支桿菌（Mycobacterium avium, Mav）。透過給予二硫蘇糖醇（dithiothreitol, DTT），產生 thiol-reductive stress 刺激三種桿菌形成生物膜（圖二）。進一步透過傅立葉轉換紅外光譜（Fourier-transform infrared spectroscopy, FTIR）分析三種桿菌的生物成分，結果顯示這三種桿菌的生物膜成分中皆含有纖維素。
圖二、Mab、Mfo 和 Mav 分別培養在含有還原態的 DTT、氧化態的 DTT 和 2-巰基乙醇（β-mercaptoethanol, β-ME）的培養液中，只有在給予還原態 DTT 的培養基中，這三種桿菌才會形成生物膜。
圖片來源： https://doi.org/10.1038/s41467-021-21748-6
接下來團隊確認纖維素能否作為偵測結核分枝桿菌生物膜的生物標記 （biomarker）。透過 CW staining（註一）來偵測纖維素（圖三），顯示能夠以纖維素作為生物標記來偵測結核分枝桿菌的生物膜的形成。接著，以纖維素作為生物標記檢測老鼠、獼猴（macaque）和人類的肺部組織切片，發現組織切片中都有檢測到結核分枝桿菌生物膜的形成。
圖三、結核分枝桿菌與外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）培養在一起，並透過 CW staining（紅）來偵測 Mtb 是否形成生物膜。結核分枝桿菌用 auramine staining（綠）來偵測。
圖片來源： https://doi.org/10.1038/s41467-021-21748-6
最後為了瞭解生物膜形成是否能保護結核分枝桿菌抵禦抗生素，該團隊將老鼠感染結核分枝桿菌後，一組只給予 Rif 和 INH 兩種治療結核病的藥物，另一組除了給予兩種藥物外，還分別給予活化的纖維素酶（cellulase）和去活化的纖維素酶。結果顯示有加纖維素酶的組別，除了有更多的結核分枝桿菌被藥物消滅外，其生物膜生成量也減少（圖四）。
圖四、結核分枝桿菌形成生物膜保護自己抵抗抗結核藥物。UT: untreated。RI: Rif + INH。RIC: Rif + INH + cellulase。RIHC: Rif + INH + inactivated cellulase。
圖片來源： https://doi.org/10.1038/s41467-021-21748-6
這篇研究證明纖維素對於結核分枝桿菌生物膜的形成扮演關鍵角色，生物膜形成保護結核分枝桿菌遠離藥物或宿主的免疫系統攻擊。此項研究為我們未來治療抗藥性結核病患者提供新的治療方向。
註一：Calcofluor White（CW）staining 是一種螢光染劑，可以偵測多醣的 β(1→4) 和 β(1→3) 糖苷鍵（glycosidic bonds）
參考文獻：
[1] Tuberculosis (TB). (2020, October 14). WHO | World Health Organization. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/tuberculosis
[2] Lebeaux, D., Ghigo, J. M., & Beloin, C. (2014). Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 78(3), 510-543. https://doi.org/10.1128/MMBR.00013-14
[3] Magana, M., Sereti, C., Ioannidis, A., Mitchell, C. A., Ball, A. R., Magiorkinis, E., … & Tegos, G. P. (2018). Options and limitations in clinical investigation of bacterial biofilms. Clinical microbiology reviews, 31(3), e00084-16. https://doi.org/10.1128/CMR.00084-16
[4] Trivedi, A., Mavi, P. S., Bhatt, D., & Kumar, A. (2016). Thiol reductive stress induces cellulose-anchored biofilm formation in Mycobacterium tuberculosis. Nature communications, 7(1), 1-15. https://doi.org/10.1038/ncomms11392
[5] Chakraborty, P., Bajeli, S., Kaushal, D., Radotra, B. D., & Kumar, A. (2021). Biofilm formation in the lung contributes to virulence and drug tolerance of Mycobacterium tuberculosis. Nature communications, 12(1), 1-17. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21748-6
撰文｜林書岑
審稿｜宋柏緯
