量產類器官 – 藥物篩選與精準醫療的新利器

類器官 (Organoid) 是由器官中不同種類細胞組成，具有組織特性的微小 3D 結構。它的大小僅有約數十微米到毫米，但卻擁有組織的複雜度，因此以類器官進行的實驗與分析，能更接近在活體中的情況，這使得類器官相當適合作為藥物篩選的對象。相較單一細胞株的細胞培養往往沒辦法反映在組織中的情形，而動物實驗則無法進行大規模的篩選，類器官讓藥物篩選可以在高通量的篩選下又能保有在活體中組織的特性。

然而類器官的量產存在技術瓶頸，以小腸類器官為例，傳統的方法是利用名為 Matrigel 的基質培養 [1]，此基質源於小鼠的肉瘤 (sarcoma) 萃取物，富含細胞外基質 (extracellular matrix, ECM)，適合 3D 細胞培養。然而這種基質是以萃取物為基礎，相較於合成的化合物，Matrigel 可控性較低；此外，Matrigel 在凝固後，較難再次被液化，後續取出類器官較為困難，使進一步的實驗操作難度增高。另一個困難是異質性的問題，傳統小腸類器官的培養方法是將小腸組織分離成片段再培養，由於片段大小不一，導致最終形成的類器官大小和形狀異質性高，後續分析容易有很大的偏誤。如果實驗想觀察的結果包含類器官的型態，則無法準確判定實驗變因與結果的關聯性。

圖一、傳統方式培養出的類器官，個體間大小與形狀差異大。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41551-020-0565-2

本篇文章的作者利用標準化的流程以及水凝膠材料的特性解決了上述的問題，使類器官的產量能夠大幅提升之外，也同時降低類器官之間形態的差異，讓後續實驗的結果能夠更加準確。在標準化方面，作者利用軟微影技術（soft-lithography）印出能用於製作單一直徑為 400 微米的孔洞陣列之模具（圖二）。每一個孔洞彼此獨立，並且可以植入欲培養的細胞。在植入細胞並且等待細胞沉至底部後，將孔洞以水凝膠或其他材料填充，亦可以依據不同的需求調整加入的材料之硬度與濃度。此陣列使每個孔洞間的類器官之間互相獨立，藉此實現高通量的分析。

圖二、利用軟微影技術 (soft-lithography) 製造微孔洞水凝膠培養基
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41551-020-0565-2

圖三、類器官在水凝膠陣列中的生長過程：最左爲第三天，最右為第八天的生長情形。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41551-020-0565-2

以往傳統的作法是直接在 Matrigel 中種入幹細胞，但往往會因細胞不均勻的分布在膠質中而無法有效聚集，而分散的幹細胞又會各自形成「數個」大小不一的細胞團，導致形成的類器官差異較大（圖四）。

圖四、比較傳統與新方法培養出的類器官差異：左圖為傳統方式培養出的類器官，大小不均且彼此混合。右圖為本篇作者的方式所培養出的類器官，每一個孔洞中的微器官大小、型態相仿，且彼此為獨立的個體。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41551-020-0565-2

另外，研究團隊也發現，幹細胞以外的已分化細胞可能是造成類器官變異性增加的關鍵因素。因此，為了解決異質性的問題，作者首先利用螢光激發細胞分選儀（fluorescence activated cell sorter, FACS）將小腸幹細胞與其他已分化細胞分離出來，再利用水凝膠的特性，使小腸幹細胞能夠自我凝聚，形成「單一」細胞團，再由該細胞團長成類器官。這樣的方式顯著的提升了類器官培養的可控性。

為了進一步比較不同傳統方法以及新方法所培養出類器官的差異，該團隊也利用不同方式進行量化分析。如圖五所示，研究主要比較了四種不同條件，分別為利用腸隱窩（intestinal crypt）組織塊（Fragments 組）與單細胞（Single cells 組）的傳統 Matrigel 培養方法，以及利用新式水凝膠微孔陣列方法，區分是否經幹細胞純化分選的 Non-sorted 組和 Sorted 組。以類器官大小（Organoid area）和培養時間上來看，傳統方法的 Fragment 組相較其他三組有很大的分布差異，而 Single cells 組雖然差異相對小，但需要較長的培養時間才可生長到與其他組接近的狀態。相較之下，使用微孔陣列新方法的兩組則同時具有低變異性和較短的培養時間。接著，

作者再以芽（Bud frequency）的數量來定量類器官的型態，Sorted 組超過 90% 都在含有 1-2 個芽的範圍內，較其他三組而言具有很高的同質性；相反的，Fragments 組中的類器官型態則有相當大的差異。值得一提的是，Non-sorted 和 Sorted 組上的型態分布也證實幹細胞純化是減少異質性的關鍵步驟。總體而言，新的水凝膠微孔陣列之培養方法減少了培養所需的時間、大幅減少個體差異，並且能一次培養出大量的類器官。

圖五、定量比較傳統 Matrigel 方法與微孔洞水凝膠陣列方法的差異
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41551-020-0565-2

最終該團隊以實際應用驗證了該培養方式的潛力。他們利用這套流程培養了一位患者大腸癌細胞所形成的類器官，作為篩選癌症藥物的對象。在篩選了 80 種已通過與正在進行臨床試驗的藥物過後，其中三種藥物使類器官產生不同於其他藥物的特徵，尤其是 Afuresertib 這個藥物會讓癌症類器官形成球狀結構。雖然本篇作者沒有定論哪些特徵代表抑制癌症的效果較佳，但是在未來透過這個培養方式與高通量的分析，並找出關鍵的特徵，必定能更快速且精準地找到最有效的藥物。

試想未來本篇作者所提出的方法能進一步地被商業化，癌症病患的癌細胞能夠在被取出後的一週內被標準化、自動化的培養成數千個類器官，就能在實際用藥前測試數百種不同的藥物。透過這個方式，能夠直接找出最適合該病患的治療方式，大幅的增加治療的效率也降低了風險，讓精準醫療更進一步。

參考文獻：

[1] Sugimoto, S., & Sato, T. (2017). Establishment of 3D intestinal Organoid cultures from intestinal stem cells. Methods in Molecular Biology, 97-105. doi:10.1007/978-1-4939-7021-6_7

[2] Brandenberg, N., Hoehnel, S., Kuttler, F., Homicsko, K., Ceroni, C., Ringel, T., … Lutolf, M. P. (2020). High-throughput automated organoid culture via stem-cell aggregation in microcavity arrays. Nature Biomedical Engineering, 4(9), 863-874. doi:10.1038/s41551-020-0565-2