流嬗與凝駐：以iETX模型探討胚胎發育過程

“It is not birth, marriage, or death, but gastrulation which is truly the most important time in your life.”
–Lewis Wolpert–

從受精卵發育為成熟的多細胞個體，需經歷多次有絲分裂增加細胞數目、擴增細胞質量與體積、並定義細胞極性（polarity）。胚胎經由各種生物因子調控，建立三個體軸（body axis patterning，分為前─後、腹─背、左─右），並在原腸胚形成（gastrulation）時經歷大規模的細胞遷移，分化出三個胚層。經歷神經系統發育（neurulation）、器官形成（organogenesis）等發育歷程後，則形成具有功能的各種組織與器官，逐漸分化出較為精細成熟的生物構造 [1] [2]。

圖一、小鼠由受精卵至成體之發育過程。受精卵經過多次卵裂，形成桑葚胚（morula），再進一步形成囊胚（blastocyst），分出內細胞群、滋胚層、與囊胚腔，著床於子宮內膜。胚胎經過體軸建立、胚層分化、與器官形成等過程後，成長為胎兒（fetus），並逐步勾勒出個體生理構造的藍圖。
圖片來源：Wolpert, L. (2015). Chapter 3: Vertebrate life cycles, experimental techniques & human development. In Principles of development.

小鼠胚胎發育主要仰賴上胚層（epiblast, EPI）、胚外外胚層（extra-embryonic ectoderm, ExE）、與內臟內胚層（visceral endoderm, VE）之間的交互作用，使胚胎由囊胚發育為卵柱（egg cylinder）的結構。先前研究 [3][4] 指出此過程間的型態變化（morphogenesis）受到細胞凋亡與整合素（integrin）訊息傳導之調控，改變細胞極性與構型，對於體腔形成（lumenogenesis）亦有關鍵的影響（圖二）。

圖二、小鼠胚胎著床時期發育階段之變化。囊胚形成後（胚胎發育 4.5 天，E4.5），EPI 於著床時受到基底膜所促進的整合素訊息傳導（E4.5 晚期至 E5.25），決定細胞的軸向。接下來細胞發生構型與位向變化，形成如玫瑰花瓣（rosette）的構造（E4.75 至 E5.0），中央則出現空腔，隨卵柱拉長而拓寬。基底膜決定了 EPI 結構的雛形，將其由對稱中空的球狀組織轉化為杯狀構造，並隨著空腔的擴增與 ExE 膜間空隙的拓展，形成初期的羊膜腔。至此，卵柱形成完畢（E5.5 至 E5.75）。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.01.023

許多研究嘗試透過幹細胞模式系統解析胚胎發育過程，然而其中機轉繁複，如何模擬各個胚胎發育時期成為一大挑戰。Magdalena Zernicka-Goetz 研究室以建立幹細胞體外培養模式探討發育機制，有頗為豐碩的成果。先前研究結合了胚胎幹細胞（embryonic stem cells, ESCs）、滋胚層幹細胞（trophoblast stem cells, TSCs）、與胚外內胚層幹細胞（extraembryonic endoderm stem cells, XEN），建構類似於胚胎的結構，稱為 ETX 模型 [5]。然而，此系統卻較難觀察到如原腸胚形成等細緻複雜的發育事件，促使團隊進一步推展技術 [6]。

究竟如何才能在胚胎發育不斷變動的過程中，攫取關鍵片刻呢？

團隊首先注意到 XEN 細胞的發育潛能較低，過往研究亦指出表現 Gata4 與 Gata6 蛋白可誘導細胞轉往內胚層分化 [7]，故嘗試於既有的 ESCs 細胞株中誘導 Gata4 基因短暫表現（稱為 CAG-tetOG4 ESCs），並透過細胞嵌合體聚集試驗（chimera aggregation assay）輔以細胞型態與蛋白表現之分析，初步驗證其分化潛能（圖三）。

圖三、於 ESCs 中短暫誘導 Gata4 表現可促使其分化為原始內胚層（primitive endoderm, PrEn）譜系細胞，並初步驗證了混合細胞聚合物中具有自我組織能力，且可形成與 VE 和 EPI 相似的結構，是胚胎發育過程的關鍵。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.12.004

為了深入了解 CAG-tetOG4 ESCs 是否可取代 XEN 細胞，團隊將其與野生型 CAG-GFP ESCs 及 TSCs 混合，並稱之為「誘導 ETX（induced ETX, iETX）胚胎」，發現細胞在五天內呈現出階段型的型態變化，且經細胞譜系標記分析亦測得高於 ETX 胚胎的細胞數。

團隊接續探討 iETX 是否能克服 ETX 難以發展出前端內臟內胚層（anterior visceral endoderm, AVE）的訊息中心（signaling center）之困境，於 E4─E5 檢測 AVE 典型蛋白標記（Cerl、Lefty1、Dkk1）的表現程度與分布，確認 iETX 可發展出具遷移能力的前端內臟內胚層（AVE）；此外，觀察發現 TS/ES 交界處表現 Brachyury（Bry，調節體軸後側形成之轉錄因子），且大多位於 Cerl 表現的對側，顯示 iETX 胚胎定義出了前─後（anterior-posterior）的體軸關係。

上皮─間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是形成各個胚層與發展體軸過程中的要素之一；在小鼠原腸胚形成時，可見 EPI/ExE 交界處 Bry+ 細胞發生 EMT，並外移至 EPI 與 VE 之間，形成中胚層。透過縮時攝影追蹤 iETX 胚胎 E4 至 E6 的動態過程，亦觀察到相似的蛋白表現與型態變化，這是 iETX 最為關鍵的技術突破（圖四）。團隊探討為其後續的分化潛能，發現 iETX 細胞可由原線（primitive streak, PS）衍生出具多種來自中胚層及內胚層譜系且表現 AVE 標記的細胞；然而 iETX 胚胎發展至 E6 後便會喪失其卵柱狀的構造，為其發育之極限。

圖四、iETX 胚胎系統可觀察到原腸胚形成與 EMT 之現象。透過縮時攝影，觀察到後側 ES/TS 交界細胞型態由柱狀轉為圓形，且逐漸遷移至 ES 與 VE-like 細胞層之間；個體前側細胞則仍維持上皮細胞的型態。過程中，進行原腸胚形成的後側細胞層逐漸增厚， PS 的長度亦穩定增加。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.12.004

團隊透過單細胞定序 [8]，比較 Day 4 的 ETX 及 iETX 和不同時期小鼠胚胎的發育潛能，發現 iETX 與 E5.5 的胚胎最為相像。此外，相較於 XEN 細胞，tetOG4 ESCs 所產生的內胚層細胞與實際的 VE 細胞更為近似，且表現出了一系列與 VE 特性、特化為 AVE、與原腸胚形成等相關之調節蛋白，這也顯示了 iETX 在分化潛能上的優勢。

本篇研究在 ESCs 中短暫表現 Gata4，誘導其成為 VE 前驅細胞，進而構建更為貼近著床後胚胎的幹細胞模式系統，並透過一系列鑑測探討其細胞命運決定（cell fate determination）及分化潛能，克服既有技術所遭遇的困境（圖五）。然而，目前 iETX 仍存在些許限制，未來仍需進一步釐清細胞生理調控機制，並評估更為適合的培養條件，以利拓展其於發育生物學研究之應用。

圖五、iETX 胚胎可模擬小鼠著床後胚胎之狀態，並具有形成前端內臟內胚層（AVE）、定義前後體軸、與原腸胚形成之潛能。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.12.004

參考文獻：

[1] Takaoka, K., & Hamada, H. (2012). Cell fate decisions and axis determination in the early mouse embryo. Development, 139(1), 3-14. https://doi.org/10.1242/dev.060095

[2] Arnold, S. J., & Robertson, E. J. (2009). Making a commitment: Cell lineage allocation and axis patterning in the early mouse embryo. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 10(2), 91-103. https://doi.org/10.1038/nrm2618

[3] Bedzhov, I., & Zernicka-Goetz, M. (2014). Self-organizing properties of mouse pluripotent cells initiate morphogenesis upon implantation. Cell, 156(5), 1032-1044. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.01.023

[4] Christodoulou, N., Kyprianou, C., Weberling, A., Wang, R., Cui, G., Peng, G., Jing, N., & Zernicka-Goetz, M. (2018). Sequential formation and resolution of multiple rosettes drive embryo remodelling after implantation. Nature Cell Biology, 20(11), 1278-1289. https://doi.org/10.1038/s41556-018-0211-3

[5] Sozen, B., Amadei, G., Cox, A., Wang, R., Na, E., Czukiewska, S., Chappell, L., Voet, T., Michel, G., Jing, N., Glover, D. M., & Zernicka-Goetz, M. (2018). Self-assembly of embryonic and two extra-embryonic stem cell types into gastrulating embryo-like structures. Nature Cell Biology, 20(8), 979-989. https://doi.org/10.1038/s41556-018-0147-7

[6] Amadei, G., Lau, K. Y., De Jonghe, J., Gantner, C. W., Sozen, B., Chan, C., Zhu, M., Kyprianou, C., Hollfelder, F., & Zernicka-Goetz, M. (2021). Inducible stem-cell-Derived embryos capture mouse morphogenetic events in vitro. Developmental Cell, 56(3), 366-382.e9. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.12.004

[7] Mathew, B., Muñoz-Descalzo, S., Corujo-Simon, E., Schröter, C., Stelzer, E. H., & Fischer, S. C. (2019). Mouse ICM Organoids reveal three-dimensional cell fate clustering. Biophysical Journal, 116(1), 127-141. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2018.11.011

[8] Klein, A. M., Mazutis, L., Akartuna, I., Tallapragada, N., Veres, A., Li, V., Peshkin, L., Weitz, D. A., & Kirschner, M. W. (2015). Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell, 161(5), 1187–1201. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.04.044

撰文｜陳品萱
審稿｜藍冠鈞