為幹細胞設計一個家：探討三維培養基材料對重編程效率的影響因子

過去十幾年裡，誘導性多能幹細胞（Induced pluripotent stem cell，以下簡稱 iPSC）的出現為幹細胞研究帶來突破性進展。iPSC 的出現源於 2007 年，Yamanaka 教授團隊以病毒為載體，送入四種轉錄因子（Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4），將體細胞誘導並轉變為多能幹細胞。在 iPSC 高速發展應用的這些年，許多研究團隊都嘗試著重編程（Reprogramming）的改良，希望能提高其效率；然而，目前的平均值約只有 1~5% [1]。

傳統上，幹細胞的培養方式是透過培養皿，使細胞貼附於平面生長，這種方法建構的生長環境屬於二維，相較於細胞本身的三維外觀，這種二維的培養方法偏離細胞在實際應用中的生長環境，細胞與基質或其他細胞間較難產生相互作用，這或許是造成細胞的實際表現與實驗結果出現落差的原因之一 [2]。為了解決這個問題，有研究團隊開始設計三維的培養環境，期望能更好地模擬生物體的條件，讓細胞的表現更貼近真實情況。

在本篇研究中，研究團隊將使用不同的材料來建立三維培養環境，並透過上皮細胞間質轉化（mesenchymal-epithelial transition ，以下簡稱 MET）的細胞比例、組蛋白修飾、多能性標的三個指標評估重編程效率。

材料選擇與配置

生物材料之選擇與處理

水凝膠（hydrogel）是一種建立三維培養環境常用的基質，而研究團隊過去的實驗結果顯示，透過調整水凝膠的表面硬度，讓水凝膠變得較軟，生長於其中的細胞在形態上變得更圓，進而提升 iPSC 初始步驟—  MET 的傾向，達到改善重編程效率的效果。

為了挑選合適的材料，研究團隊在細胞培養板分別塗上明膠（gelatin）、玻尿酸（hyaluronic acid，簡稱 HA）、藻酸鹽（alginate）、殼聚醣（chitosan）、I 型膠原蛋白 （Col I）、纖維連接蛋白（fibronectin）或層連結蛋白（laminin），再將可表達 OCT4-GFP 的小鼠胚胎幹細胞 （OG-mESCs）培養於其中，並以移除mLIF （mouse leukemia inhibitory factor）這個細胞發展多能性的關鍵因子的方式，觀察細胞的重編程表現，而實驗結果顯示玻尿酸與殼聚醣可能是有潛力的候選材料。

在後續實驗中，團隊使用 methacrylic anhydride 或 Glycidyl methacrylate 將候選材料（包含 gelatin、HA、chitosan）進行化學處理，得到 MAGel、MAHA 與 MAChi，再混合水凝膠進行研究，並以 PEG 二丙烯酸酯（PEGDA）水凝膠作為對照組。

MAHA 水凝膠的剛度與重編程效率之關聯性

研究團隊想了解不同比例配置的 MAHA 水凝膠會如何影響重編程效率，因此使用了四種剪力模數（shear modulus）—— DS10、DS50、DS80 和 DS100 進行比較。結果顯示，模量越高，重編程的效率越低，這意味著材料剛度的增加可能會干擾 MAHA水凝膠與其他物質作用，使用較軟的材料或許可以有較佳的重編程效率。

重編程效率之探討

mESCs 在二維與三維環境下的多能性

研究團隊分別設計二維與三維的培養環境以比較四種材質的重編程效率。實驗中使用 OG-mESCs，並以下列 3 種指標進行評估：

1. MET 的細胞比例
2. 組蛋白修飾
3. 多能性標的

二維環境的實驗結果顯示，移除 mLIF 時，MAHA 與 MAChi 水凝膠的 OCT4-GFP 表現量顯著；MAGel 水凝膠在移除 mLIF 後，蛋白與多能性標的物的表現量顯著下降（圖一 B）；此外，在 MAHA 水凝膠的環境中，無論是否移除 mLIF，多能性標的的表現量無顯著差異（圖一 C、圖一 E）。

不同材料構築的三維環境中， MAHA 水凝膠在多能性表現上明顯優於其他三組（圖一 F~J），且這種優勢相較於二維的實驗結果中要來的顯著，因此，研究團隊推測 MAHA 材料能在細胞轉變為 iPSC 的過程中扮演關鍵角色。

在不同材料環境的重編程效率

研究團隊除了衡量在不同材料構築的三維環境下細胞重編程的效率，為探索重編程過程，在研究中更進一步透過組蛋白變化（如：甲基化（methylation）、乙醯化（acetylation））了解細胞的染色質重塑（chromatin remodeling）情形。

研究結果顯示，MAChi 、 MAHA、MAGel 水凝膠中的 OCT4-GFP+ 細胞量相較於二維環境時有顯著增加（圖二 B）；OCT4、NANOG、E-cadherin 在 MAHA中明顯高於其他三組，而 SOX2 與 N-cadherin 的表現相較其他組則未有顯著差異（圖二 D~H）；另外，研究團隊觀察到 MAHA 水凝膠的染色質有出現重塑（圖二 J），這可能是種細胞克服重編程障礙的重要步驟，因此認為 MAHA 水凝膠可能成為推動 iPSC　研究的希望材料。

可能影響因子—CD44

MAHA 水凝膠與 CD44 的交互作用

過去研究顯示，細胞中的 CD44 可能與 HA 這種材料出現交互作用，進而影響細胞內的訊號傳遞[3]，為了瞭解這種交互作用隊重編程過程的影響，本實驗研究團隊使用　shRNA （shCD44）降低細胞的 CD44 表現（圖三 B），並與正常細胞（shCon）分別培養於 MAHA 水凝膠中進行比較。

結果顯示，由於　shRNA　中 CD44/HA 間相互作用減少，因此降低了重編程的效率；透過其他指標，研究團隊也觀察到，shCon 在 OCT4-GFP + 細胞中的 GFP 強度、多能性標的與 E-cadherin 的表現量都明顯高於 shRNA（圖三 C~H）。

結語

研究團隊透過三維環境的改良，以 Yamanaka 當年提出的實驗方法為研究基礎，從多面向切入，最終結果揭示著 MAHA 水凝膠成為未來三維培養基潛力之星的可能性；此外，材料與細胞內物質之間的交互作用（如 : CD44/MAHA 水凝膠），或許也是影響 iPSC 重編程效率的重要因子。

參考文獻：

[1] Stadtfeld, M., & Hochedlinger, K. （2010）. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes & development, 24（20）, 2239–2263. https://doi.org/10.1101/gad.1963910

[2] Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., & Solomon, F. D. （2015）. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of cellular physiology, 230（1）, 16–26. https://doi.org/10.1002/jcp.24683

[3] Ponta, H., Sherman, L., & Herrlich, P. A. （2003）. CD44: from adhesion molecules to signalling regulators. Nature reviews. Molecular cell biology, 4（1）, 33–45. https://doi.org/10.1038/nrm1004

撰文｜游霈柔
審稿｜梁文