隨著誘導性多能幹細胞（induced pluripotent stem cell, iPSCs）在新藥開發及再生醫學領域中扮演的角色日趨重要，如何穩定且有效率的製備誘導性多能幹細胞已然成為了一個重要的課題。現行的主流製程是以層連結蛋白（laminin）為培養基質，進行平面的細胞培養。然而近年來已有大量的研究指出 [1]：平面培養無法完整的展現細胞於活體內（in vivo）的生化活動，甚至會表現出不同的細胞行為。為了解決此問題，逐漸發展出了立體細胞培養（3D cell culture）的技術，如今市面上已有許多產品，相關產業及研究活動的進展也十分蓬勃。來自德國柏林自由大學（Freie Universität Berlin）的團隊以製備誘導性多能幹細胞為目的，進一步開發出用於立體細胞培養的溫度感應性水膠（thermoresponsive hydrogel），利用其溫度感應性輔助釋放培養完成的細胞 [2]。
圖片說明: 圖一、成膠流程
圖片來源：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adfm.202010630
此水膠以 pNIPAAm-co-PEG-N3（poly(N-isopropylacrylamide)-co-polyethylene glycol azide）及 dPG-BCN（dendritic polyglycerol-bicyclononyne）為主要骨幹。其成膠方式分為兩段，一為 N3（azide）及 BCN（bicyclononyne）的化學交聯（crosslinking）反應；二為 pNIPAAm-co-PEG 的物理成膠。此物理成膠機制源自於 pNIPAAm，其乃一種著名的溫度感應性水膠。當環境溫度高於低臨界溶液溫度（lower critical solution temperature, LCST），水膠的分子會形成更緊密的排，讓膠體的硬度進一步提升。同時，原先透明的膠體也會轉變為白色的不透明狀。
如此一來，當細胞甫被包覆於水膠中時，第一段的化學交聯提供了初步的固定；而在細胞培養過程中，環境溫度升至 37°C，第二段的物理成膠使此膠體形成更穩定的微環境，利於誘導性多能幹細胞的生長及擴增；最終，使用者又可再度降低溫度，便於將細胞由膠體中分離而出（圖一）。另外，為了使此水膠具有一定的細胞可貼附性，經 BCN 官能基修飾的 RGD 肽鏈 [註]（RGD-BCN）亦透過 N3-BCN 交聯反應連接到 pNIPAAm-co-PEG-N3 上。
在以平面細胞培養為主的研究中，材料的機械性質，如硬度（stiffness）及彈性（elasticity）較受到關注，這些因素確實會影響細胞生長情形。但隨著立體培養的發展，考量到細胞是完全被培養基質包覆，當細胞增生，細胞所需的生長空間或移動範圍可能會增加。這時就需要培養基質具有一定的流體性質，方不會過度侷限細胞的增生（圖二），使得代表流體性質的黏滯性（viscosity）亦逐漸受到重視。現今，人們常以黏彈性（viscoelasticity）統一描述材料的彈性與黏滯性，而流變儀（rheometer）則是常用的測量儀器。
圖片說明: 圖二、細胞生長受材料的機械性質影響
圖片來源：https://www.nature.com/articles/nmat4489
為了找出最適合的細胞培養基質，團隊調控成膠時 pNIPAAm-co-PEG-N3 及 dPG-BCN 的比例及濃度，測量其硬度、黏滯性（圖三），結果顯示可透過調整水膠成份比例達到不同材料性質。進一步觀測細胞生長情形。發現當以 pNIPAAm-co-PEG-N3：dPG-BCN＝2:3 的水膠（G’(E)=330Pa）進行培養時，誘性多能幹細胞展現出最高的存活率；而在不同濃度水膠的比較中，培養於 gel2（G’(E)=357Pa）的誘導性多能幹細胞具有最高的細胞增生率。根據此結果，該研究團隊最終選擇 G’(E)=357Pa 作為標準的培養條件。
圖片說明: 圖三、不同 pNIPAAm-co-PEG-N3 及 dPG-BCN 的（A）比例及（B）濃度之下膠體的彈性模數（elastic modulus, G’）及黏性模數（viscous modulus, G”）。（A）pNIPAAm-co-PEG-N3 及 dPG-BCN 溶液濃度皆固定為 100 mg mL−1，以不同比例混合； (B) gel1 至 gel4 的 pNIPAAm-co-PEG-N3 及 dPG-BCN 溶液濃度分別為 200、100、75 及 50 mg mL−1，成膠時以 1：1 混合。
圖片來源：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adfm.202010630
最終，透過對 Nanog、Sox2、Oct4 及 SSEA1（pluripotent markers） 的免疫染色，此研究展示了培養後的幹細胞依然有上述基因表現，這代表經過培養製程，誘導性多能幹細胞仍保有其多能性（pluripotency）。
總結來說，此研究的重要性之一在於完全使用化學合成的材料，這代表此水膠的成分是全然已知的，使用者幾乎可以完整的操控其中所有因子，並不像如 Matrigel 等生物衍生（bio-derived）的水膠具有未知且不可控的成分。另外，該水膠的溫度感應性使製程的利性大為增，縱然升溫導致的膠體透明度變化會影響細胞培養過程中的觀測，此水膠培養製程仍有望幫助自體幹細胞療法的發展。
註：RGD肽鏈——精甘天冬氨酸肽（Arginylglycylaspartic acid, RGD peptide）為一典型的細胞貼附胜肽鏈（cell adhesion peptide），其可與細胞表面的整合素（integrin）結合，形成細胞貼附的行為。
參考文獻:
- Baker, B. M., & Chen, C. S. (2012). Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. https://doi.org/10.1242/jcs.079509
- Liang, W., Bhatia, S., Reisbeck, F., Zhong, Y., Singh, A. K., Li, W., & Haag, R. (2021). Thermoresponsive Hydrogels as Microniches for Growth and Controlled Release of Induced Pluripotent Stem Cells. Advanced Functional Materials, 31(40), 2010630. https://doi.org/10.1002/adfm.202010630
- Chaudhuri, O., Gu, L., Klumpers, D., Darnell, M., Bencherif, S. A., Weaver, J. C., Huebsch, N., Lee, H. P., Lippens, E., Duda, G. N., & Mooney, D. J. (2015). Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nature Materials, 15(3), 326–334. https://doi.org/10.1038/nmat4489
撰文｜蕭亘谷：現為德國德勒斯登萊布尼茲高分子研究所博士生（特約撰稿）
審稿｜梁文、黃云宣
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