人類的頭骨並非單一骨架，而是由 8 塊顱骨與 14 塊顏面骨組成，銜接顱骨的縫隙被稱為顱縫（cranial suture），其會隨出生後的發育過程逐漸癒合 [1]。顱縫間質是連接顱骨的結締組織，充斥著由神經脊（neural crest）與中胚層（mesoderm）衍生出的顱縫間質幹細胞（suture mesenchymal stem cell, SMSC），當顱縫間質中的幹細胞群分化異常時，便會發生顱縫線封閉過早的情形 [1] [2]。
顱縫線封閉過早症候群（craniosynostosis）是常見的發育缺陷疾病之一，會導致新生兒頭骨異常與畸形，嚴重者會引起發育遲緩、呼吸和神經系統功能障礙等併發症。目前臨床上主要透過手術矯正治療，故針對外科手術搭配的組織再生技術便顯得極為重要 [3]。本篇研究著重於生物材料的開發，以維持顱縫間質幹細胞的幹性（stemness），並借助支架的物理性質來調節幹細胞分化。
圖一、健康成人頭骨的頂視圖（左）與側視圖（右）
圖片說明：線處顯示頭骨當中的顱縫線，人類頭顱在剛出生時有 4 大縫隙，隨著出生後發育成長隨之閉合。
圖片來源：https://doi.org/10.4161/org.23307
圖二、顱縫間質示意圖
圖片說明：顱縫間質（紅色處）由顱縫間質幹細胞所組成，此區域充斥結締組織，提供顱骨幹細胞生長所需的微環境。兩側顱骨前緣由礦化的成骨細胞（osteoblast）組成，成熟的骨細胞（mature osteocyte）包埋於骨基質中。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.120769
本篇研究選用具備生物相容性的高分子—左旋乳酸（poly-L-lactic acid, PLLA）作為材料 [4]，使左旋乳酸聚合形成三維的網狀結構，在特定條件下建構出不同尺寸的孔隙，分別是：大孔(large pore, 250-425 μm）、中孔（medium pore, 125-250 μm）與小孔（small pore, 63-125 μm）。在掃描式電子顯微鏡的分析結果中，可見支架中均勻分布相互連接的球形孔徑，有利於細胞於此結構當中遷移並進行物質運輸；在高倍鏡分析下顯示，支架具備一致大小的奈米纖維表面，有利於細胞的貼附與增殖。
圖三、三維支架孔徑型態圖
圖片說明：通過掃描電子顯微鏡分析由左旋乳酸製成的支架孔徑型態。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.120769
分析所生成支架材料的孔徑大小、孔徑分布與整體結構後，研究者由健康小鼠中分離出顱縫來源的間質幹細胞（suture mesenchymal stem cell , SMSC）與長骨骨髓來源的間質幹細胞（bone marrow mesenchymal stem cell , BMSC），培養於三種不同孔徑大小的支架上，依序分析細胞的礦化能力、組織血管新生、以及基因表現。
體外培養 24 小時後以電子顯微鏡進行初步驗證，顯示二種間質幹細胞在三種大小的孔洞支架中皆分布良好；體外培養 24 小時後，將細胞支架植入小鼠的皮下組織進行體內培養，8 週後以茜素紅染色（Alizarin red staining）分析細胞的鈣化程度，實驗結果顯示 BMSC 具備最高的鈣化能力，且在大孔徑組別中，二種來源的間質幹細胞比其他孔隙的組別具備更顯著能力；反之，在小孔組別中鈣化的效果似乎受到了限制。另一方面，血管新生與胞外基質填充（extracellular matrix, ECM）是顱骨形成的先決條件，故研究者針對支架所促成的血管新生進行分析，可見在小孔徑支架的組別當中，在 4 週的體內培養雖能發生血管新生，然而血管新生的直徑與深度受到限制；反之在大孔徑的組別當中，在 4 週後可見成熟且分布完整的血管脈叢，且血管的直徑可隨著體內培養時間延長而增加，同時組織間充斥較成熟且完整的胞外基質。
圖四、細胞鈣化程度（上排）與血管新生程度（下排）定量圖
圖片說明：針對細胞鈣化程度以茜素紅染色（Alizarin Red Staining）並以強度進行定量；以血管內皮細胞的生物標記 CD31+ 進行免疫染色分析，統計血管的穿透深度（左）與直徑（中）；以天狼星紅染色（Picro-Sirius Red Stain）鑑定組織中的膠原纖維（下排右），作為胞外基質定量。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.120769
最後針對體內培養二種間質幹細胞進行基因表達的分析，結果顯示在小孔徑的組別當中，幹細胞生物標記 Gli1 和 Col3 的表達明顯增加，同時可見成骨相關的基因表現有下降的趨勢。反之，針對大孔徑的組別當中，有關幹細胞特性的基因表現量是低的，但有關成熟細胞基質的生物標記 Col1、血管新生的生物標記 VEGF、以及骨分化生物標記 BSP 的表現量有顯著上升的情形，顯示出支架的孔徑會決定間質幹細胞分化與否的走向。
圖五、基因表達熱點圖
圖片說明：收取皮下培養的細胞支架並進行基因表達分析，將培養 4 週與 8 週的熱點圖以趨勢作彙整並呈現。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.120769
總結來說，本篇研究指出支架的孔徑大小是影響幹細胞分化命運的關鍵因素。在小孔徑的支架中，有利於維持間質幹細胞的幹性，防止細胞過早進行骨分化發展；在大孔徑的支架中，該環境能夠有效促進胞外基質成熟、發展出穩健的血管，並促使間質幹細胞走向骨分化與鈣化的路徑。此研究著重於細胞與生物材料間的交互作用，提升組織工程學的實際應用潛力。至於針對顱縫線封閉過早症候群的臨床應用，仍需後續研究加以驗證，包括此疾病的遺傳性因素、個體中異常的訊息分子傳導等，分子生物層次的調控機制與支架中細胞的交互影響仍待評估與分析 [1][5]。
參考文獻：
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撰文｜陳祈瀅
審稿｜梁文
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