生理時鐘分子的轉譯後修飾 — SUMO 修飾決定 PER2 蛋白的命運

晝夜節律與健康
熬夜與晚睡已成為多數現代人生活的一部分，而這種夜貓子的生活型態對健康造成的影響也是許多研究關注的重點（圖一）。過去的研究已經發現晝夜節律廣泛的影響細胞、組織、器官系統等層次，晝夜節律失調也被證實與神經、心血管、代謝、免疫等方面的疾病密切相關 [1]。隨著越來越多的研究證實晝夜節律對健康的影響，了解體內這些「看不見的時鐘」是如何運作便顯得越發重要。

圖一：從衛星影相中看到的點點燈火，是現代人夜間活動最直接的體現。
圖片來源：https://earthobservatory.nasa.gov/images/79790/city-lights-of-asia-and-australia

晝夜節律是什麼
晝夜節律是細胞隨著日夜變化進而調節生理機能的週期性機制，並以負回饋循環 (negative feedback loop) 為基礎運作。白天時 BMAL 和 Clock (CLK) 兩個蛋白共同活化 enhancer box (E-BOX) 並表現下游基因，其中的 Period (PER) 和　Cryptochrome (CRY) 兩個蛋白會在白天漸漸累積，到了晚上累積的 PER 和 CRY 便會抑制 BMAL 和 CLK的作用，並抑制自身的表現，形成一個負回饋循環。隨著夜晚過去， PER 和 CRY 被分解，新的循環再次開始形成最基本的節律。核心時鐘的調控通常不只一個迴路，例如脊椎動物體內還有另一個由轉錄活化蛋白 ROR 和轉錄抑制蛋白 Rev-ERB 組成的負回饋循環 (圖二) [2]。

圖二：晝夜節律的分子機制圖。
圖片來源：https://masrilaboratory.com/research-overview-2/

晝夜節律的轉譯後修飾
轉譯後修飾是指蛋白質分子上被添加小分子，這樣的修飾可能會使蛋白質結構有些許改變，且影響其功能性。在生理時鐘蛋白的轉譯後修飾中較為人所知的是磷酸化 (phosphorylation) [3] 及泛素化 (ubiquitination) [4]，但其他修飾在生理時鐘蛋白中的功能性角色仍較鮮為人知。SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) 是一群能夠以共價鍵在其他蛋白進行修飾的小蛋白分子，也屬於轉譯後修飾的一種，並影響目標蛋白在細胞中的運輸與安定性。SUMO 修飾一般分成 SUMO1 和 SUMO2：SUMO1 是單體且通常有助於核運輸 (nuclear transport) 及防止泛素化，SUMO2 則是傾向促進泛素化及後續的蛋白分解 [5]。中研院基因體中心黃雯華老師領軍的團隊便是探討 SUMO 修飾對於生理時鐘蛋白 PER2 中的功能性角色 [6]。

團隊首先利用 PLA 證明了人類細胞中的 PER2 蛋白會被 SUMO 修飾 (圖三，註)，並進一步使用 GPS-SUMO 軟體預測 PER2 蛋白中潛在會被 SUMO 修飾的氨基酸位點，進而探討不同位點的 SUMO 修飾對於 PER2 的影響：

藉由軟體預測後得知 PER2 蛋白有三個潛在的 SUMO 修飾位點：都位在離胺酸 (Lysine, K)，分別為 K87、K736、K1163 。團隊將離胺酸進行點突變，也就是將其置換為不會被 SUMO 修飾的精胺酸 (Arginine, R) 後，發現只有 PER2 K736R 突變細胞株 (將 K736置換成 R736) 會較不容易被降解，表示 K736 位點的 SUMO 修飾對 PER2 蛋白的穩定性至關重要。為了確認 PER2 磷酸化及 SUMO 發生的因果關係，團隊在加入 CK1 抑制劑後，發現 CK1 會促進 PER2 蛋白 S662 位點的磷酸化，但不影響 SUMO 修飾，顯示 SUMO 修飾並不仰賴 S662 的磷酸化。相反地，PER2 K736R 突變株不但使 SUMO 修飾下降，也會使 S662 磷酸化降低，顯示 SUMO 修飾會誘導 S662 的磷酸化。

圖三：PER2 蛋白會被 SUMO 修飾。圖中紅色螢光標記代表被接上 SUMO-1的 PER2，多數DAPI染色的細胞中都有出現紅色螢光表示這些細胞裡的 PER2 都可以被接上 SUMO-1。
圖片來源： https://doi.org/10.1038/s41598-021-93933-y

綜合以上結果，團隊認為 PER2 蛋白 K736 位點的 SUMO1 修飾不但會促進 PER2 S662 位點的磷酸化也會促進 PER2 抑制基因轉錄的功能。相反地，PER2 蛋白 K736 位點的 SUMO2 則是會促進 S480 位點的磷酸化及 PER2 蛋白自身的分解，顯示不同 SUMO 修飾對 PER2 蛋白會有特定的調節作用（圖四）。這項發現使我們對生理時鐘蛋白的轉譯後修飾的了解跨出了新的一步，而這些基礎發現的累積也會一步步幫助科學家們理解這些「看不見的時鐘」是如何影響生理機制與健康。

圖四：PER2 進行 SUMO 修飾的分子機制圖。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41598-021-93933-y

註：PLA (Proximity Ligation Assay)的原理是使用一級抗體辨識目標蛋白，並在二級抗體接上 DNA 探針。若兩個蛋白彼此有交互作用，二級抗體上的 DNA 探針則可作為引子 (primer) 並進行滾環擴增 (rolling circle amplification) 將訊號放大約 1000 倍，最後再進行螢光訊號的觀察。

參考文獻：

1. Fishbein, A. B., Knutson, K. L., & Zee, P. C. (2021). Circadian disruption and human health. The Journal of clinical investigation, 131(19), e148286. https://doi.org/10.1172/JCI148286
2. Crumbley, C., & Burris, T. P. (2011). Direct regulation of CLOCK expression by REV-ERB. PloS one, 6(3), e17290. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017290
3. Reischl, S., & Kramer, A. (2011). Kinases and phosphatases in the mammalian circadian clock. FEBS letters, 585(10), 1393–1399. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2011.02.038
4. Stojkovic, K., Wing, S. S., & Cermakian, N. (2014). A central role for ubiquitination within a circadian clock protein modification code. Frontiers in molecular neuroscience, 7, 69. https://doi.org/10.3389/fnmol.2014.00069
5. Hay R. T. (2005). SUMO: a history of modification. Molecular cell, 18(1), 1–12. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2005.03.012
6. Chen, LC., Hsieh, YL., Tan, G.Y.T. et al. Differential effects of SUMO1 and SUMO2 on circadian protein PER2 stability and function. Sci Rep 11, 14431 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-93933-y