俗話說：「休息是為了走更長遠的路。」睡眠對所有生命體都同樣重要，以人類而言，我們一生中有約三分之一的時間花費在睡眠上，這種具有週期性的醒睡行為也被稱為晝夜節律（circadian rhythm），並受到數種因子調控。
【2017 年諾貝爾生理醫學獎】
2017 年的諾貝爾生醫獎頒給了對於提出睡眠調控機制有重大貢獻的科學家——Jeffrey Hall、Michael Rosbash，以及 Michael Young 。他們以果蠅為實驗模型，對其生理時鐘分子的調控提出了基礎理論：CLK 與 CYC 蛋白在白天時共同提高 PER （period） 及 TIM （timeless） 蛋白的產量（註一），因此 PER 及 TIM 逐漸累積，直到夜晚，TIM 與 PER 蛋白在累積後逐漸結合為異二聚體 （heterodimer） ，進入細胞核抑制本身蛋白的基因表現，這些蛋白與基因的相互調控形成了一個負回饋循環［1-3］。時間再次進入白天， TIM 蛋白開始被分解，而 PER 蛋白則被 DBT 蛋白磷酸化而無法作用，因此 CLK 和 CYC 蛋白又能繼續活化 timeless 、period 基因，並進行第二輪的調控循環［4, 5］，因此找出可以調控上述生理時鐘分子的因子也成為科學家們的研究焦點之一。本篇研究以果蠅為實驗模型，並藉由辨別 TIM 蛋白的磷酸化位點，試圖找出影響 TIM 磷酸化的因子及其與晝夜節律的關係［6］。
延伸閱讀：生理時鐘分子的轉譯後修飾 — SUMO 修飾決定 PER2 蛋白的命運
圖一：晝夜節律調節機制。（A) 晚上、（B) 白天。
圖片來源：Ibáñez, C. （2017）. Discoveries of Molecular Mechanisms Controlling the Circadian Rhythm The 2017.
【果蠅腦中 TIM 蛋白的磷酸化位點】
研究團隊首先在不同時間點取出果蠅的腦組織，並純化 TIM 蛋白再進行質譜分析找到 12 個 TIM 的磷酸化位點，再選定在動物中高度保守（highly conserved）的 TIM（S1404） 作為後續研究的主要目標位點。此位點位於 TIM 蛋白中的細胞質定位區域（cytoplasmic localization domain, CLD） 中，因此磷酸化可能會影響 TIM 在細胞核中的累積過程。研究中使用了二種不同突變序列——無法磷酸化（non-phosphorylatable）的 tim（S1404A）、模擬磷酸化的 tim（S1404D），與對照組 tim（WT） 進行比較。
【TIM S1404 位點磷酸化調控 PER-TIM 二聚體】
研究人員接著分析細胞核內 TIM 的表現量及其佔整個細胞總量的百分比 (圖二)，並認為 S1404 位點的磷酸化能促進 TIM 在核內的累積。由於 TIM 本身是促進 PER-TIM 二聚體進入細胞核的重要因子，研究團隊也針對 PER 的累積量進行分析 (圖三)，發現無法磷酸化的 TIM 同樣會影響 PER 蛋白在細胞內的定位。
圖二：在細胞核內 TIM 佔總量 TIM 的百分比分析中（圖二 – A） ， tim（S1404A） 在 ZT20 與 ZT22 時明顯較低（註二），而 tim（S1404D） 在 ZT16 及 ZT22 時都略高於 tim（WT）。針對細胞核內 TIM 蛋白表現量的分析中（圖二 – B）， tim（S1404D） 在 ZT16 到 ZT18中，核內 TIM 表現量皆高於 tim（WT）。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.061
圖三：兩圖呈現的是 PER 在細胞核中的累積量以及其佔總量的比例，在 ZT22 時，tim（S1404A）都是其中表現量最低的。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.061
【TIM-XPO1 蛋白之間的交互作用】
CRM1 是一種存在於哺乳類的運輸蛋白［7］，能促使蛋白質從細胞核輸出至細胞質， 而蛋白質中的細胞核輸出信號區域 （nuclear export signal, NES） 可以調節蛋白與 CRM1 結合，讓原本在細胞核內的蛋白向外移。研究團隊在 TIM 蛋白 S1404 位點附近找到類似 NES 功能的胺基酸片段，並試圖釐清 TIM S1404 磷酸化與 XPO1 蛋白（果蠅中類似 CRM1 功能的蛋白） 間的交互作用。經過生化實驗分析後團隊發現： S1404 磷酸化的 TIM 蛋白會干擾 XPO1 相關途徑，減少自身從細胞核中外移。
【CLK磷酸化與位相前進】
上述結果顯示，若 TIM S1404 無法被磷酸化，則會減少在細胞核內累積的 TIM-PER，因此團隊決定檢視 CLK 蛋白的表現量是否與此相關。在分析不同時刻下 per 與 tim mRNA 的表現量後 (圖四)，研究團隊發現：無法被磷酸化的 tim（S1404A）雖然 CLK 蛋白的總表現量改變不大， 磷酸化程度卻會減少，使其活性提升，讓受調控的生理時鐘相關基因表現情形比 tim（WT）大幅提前，這個現象被稱為『位相前進 （phase advance） 』 （註三）。通過這個觀察，研究團隊認為 TIM S1404 位點磷酸化除了會影響 TIM-PER 在細胞核內的累積，也會透過 CLK 蛋白影響生理時鐘基因表現的節律。
圖四：分別分析 per 和 tim ，兩者在 tim（WT） 及 tim（S1404A） 的情況相似，在 ZT16 ~ ZT24 間，tim（S1404A） 的 per 與 tim 含量較 tim（WT） 為低，但在 ZT8 時 tim（S1404A） 的 per 和 tim 含量都比 tim（WT） 高。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.061
【磷酸化 TIM 的激酶——CK2】
由於 TIM S1404 位點可以影響 TIM-PER 二聚體在細胞內的位置，因此團隊試圖以 KinasePhos 2.0 軟體預測最有可能磷酸化此位點的激酶 （kinase），並選定 CK2 為首要目標，進行功能性測試 （functoinal assay）。結果顯示，若在果蠅神經中將 CK2 蛋白進行突變，使其無法進行磷酸化功能， 會使夜晚時期的 TIM S1404 磷酸化下降，造成 TIM-PER 二聚體無法在細胞核內累積，顯示由 CK2 調控 TIM S1404 位點的磷酸化是 TIM-PER 二聚體進入細胞核的關鍵。
【結語】
本篇研究探討了 TIM S1404 位點磷酸化對晝夜節律機制的影響面向 —— 在夜晚剛開始時，CK2 會磷酸化 TIM S1404 位點，並促進 TIM-PER 二聚體進入細胞核，進入核內的 TIM-PER 則會抑制其與運輸蛋白 XPO1 作用，進而提升其在細胞核內的累積量並透過 CLK 影響後續基因表現的節律 (圖五)。有趣的是，研究中觀察到的位相前進現象與人類家族性睡眠相位前移症候群（human familial advanced sleep phase syndrome, FASPS）狀況相似，或許能為此睡眠疾患提供新的研究方向與治療線索。
圖五：CK2 會藉由 磷酸化 TIM 蛋白進而調控 TIM-PER 二聚體累積在細胞核內的過程及後續的基因表現。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.061
註一：果蠅中的 CLK 及 CLC 蛋白與哺乳類的 CLOCK 與 Bmal1 蛋白 為同源基因 （orthologs），在生物中具有高度保守性。
註二：ZT 指的是定時器時間（Zeitgeber time, ZT） ，這是實驗室環境所訂定的環境時間， ZT0 為白天開始時，或是開燈時間； ZT12 則為夜晚開始時，也就是關燈時間。
註三：位向前進通常用來描述晝夜節律的狀態變化，這種改變會使睡眠與甦醒提前。
註四：人類家族性睡眠相位前移症候群是一種睡眠疾患，病人的晝夜節律相較於一般人提前，在傍晚時會進入想睡狀態，並在清晨大部分人還在熟睡時醒來。
參考文獻
1. Hardin, P. E., Hall, J. C., & Rosbash, M. (1990). Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature, 343(6258), 536–540. https://doi.org/10.1038/343536a0
2. Saez, L., & Young, M. W. (1996). Regulation of nuclear entry of the Drosophila clock proteins period and timeless. Neuron, 17(5), 911–920. https://doi.org/10.1016/s0896-6273(00)80222-6
3. Taylor, P., & Hardin, P. E. (2008). Rhythmic E-box binding by CLK-CYC controls daily cycles in per and tim transcription and chromatin modifications. Molecular and cellular biology, 28(14), 4642–4652. https://doi.org/10.1128/MCB.01612-07
4. Price, J. L., Blau, J., Rothenfluh, A., Abodeely, M., Kloss, B., & Young, M. W. (1998). double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates PERIOD protein accumulation. Cell, 94(1), 83–95. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)81224-6
5. Yu, W., Zheng, H., Houl, J. H., Dauwalder, B., & Hardin, P. E. (2006). PER-dependent rhythms in CLK phosphorylation and E-box binding regulate circadian transcription. Genes & development, 20(6), 723–733. https://doi.org/10.1101/gad.1404406
6. Cai, Y. D., Xue, Y., Truong, C. C., Del Carmen-Li, J., Ochoa, C., Vanselow, J. T., Murphy, K. A., Li, Y. H., Liu, X., Kunimoto, B. L., Zheng, H., Zhao, C., Zhang, Y., Schlosser, A., & Chiu, J. C. (2021). CK2 Inhibits TIMELESS Nuclear Export and Modulates CLOCK Transcriptional Activity to Regulate Circadian Rhythms. Current biology : CB, 31(3), 502–514.e7. https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.061
7. Nguyen, K. T., Holloway, M. P., & Altura, R. A. (2012). The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology, 3(2), 137–151.
撰文｜游霈柔
審稿｜蕭皓文
