過去科學家們通常各自透過分析轉錄體 (transcriptome)、蛋白質體 (proteome) 得知細胞對日夜節律的反應；然而近十年間發現，mRNA 種類的變化無法與蛋白質種類的變化兩相對應，可見轉譯後修飾 (post-translational modification) 也扮演關鍵角色。先前有許多研究探討蛋白質乙醯化 (acetylation)、磷酸化 (phosphorylation) 如何影響日夜節律，然而尚未有研究闡明影響蛋白質降解的泛素 (ubiquitin)會怎麼隨日夜。本篇文章便是聚焦分析果蠅腦部的蛋白質泛素化 (ubiquitination) 修飾與日夜節律的關聯 [1]。
一開始，研究者們嘗試藉由生物素 (biotin) 標記泛素，藉此辨認被泛素化的蛋白質。在茫茫的蛋白質大雜燴之中，透過質譜儀資料辨別只有約 300 種蛋白質在TIMELESS (TIM) 基因正常表現時，被顯著泛素化。其中 52 種蛋白質在一天 4 個時間點之間 (00:00, 06:00, 12:00, 18:00，00:00 開始 12 小時白天、接著 12 小時黑暗)，具有明顯濃度變化，而這些蛋白質的功能均與神經、記憶相關。其中在 6:00 時最多，有 43 種蛋白質被泛素化，且 Megator (MTOR) 蛋白的變化達 29 倍（圖一）。如果與轉譯程度比較，只有 3 蛋白及 mtor mRNA 同時展現週期性的轉譯、泛素化調控。
圖一：MTOR蛋白質濃度隨時間的變化。 圖片來源：Szabó, Á. et al. (2018) Ubiquitylation dynamics of the clock cell proteome and TIMELESS during a circadian cycle. Cell reports, 23(8), 2273-2282.
為了確認透過質譜儀辨識的週期性蛋白質，團隊針對其中7 種蛋白質以西方墨點法分析，結果發現只有 MTOR 蛋白表現最顯且一致的素化動MTOR 蛋白已知是組成核孔 (nuclear pore) 基部的成員之一，調控大分子進出細胞核。恰好，已知調控果蠅日夜周期的關鍵蛋白質 TIM 和 PER (PERIOD基因) 會規律的在傍晚由細胞質移動至細胞核。所以研究者們利用干擾型 RNA (RNA interference, RNAi)，抑制 mtor 的基因表現，結果觀察到 ：(1) TIM 和 PER在半夜時分，依然出現在細胞質內，(2) TIM 和 PER 在白天的濃度增加，(3) 果蠅本身的日夜周期也被延長（圖二）。可見 MTOR 蛋白本身的功能的確可以影響到生物節律。
圖二：這個圖被稱作Actogram，每天（橫列）的黑灰色小短柱代表果蠅有活動。LD包含前3天，表示環境有12小時亮暗週期，DD包含第4至第15天，表示連續黑暗環境。左邊是控制組，其活動周期為23.5小時，右邊是Mtor被抑制的實驗組，其活動周期為25.2小時。
圖片來源：Szabó, Á. et al. (2018) Ubiquitylation dynamics of the clock cell proteome and TIMELESS during a circadian cycle. Cell reports, 23(8), 2273-2282
另一方面，團隊也很好奇 TIM 蛋白質的濃度如何隨著日夜交替改變。被泛素化的TIM (Ub-TIM) 的總量從 15:00 開始提升，到 21:00 達高峰。然而對於 TIM 蛋白總量進行標準化之後，Ub-TIM 的比例至 00:00 才達高峰，一路下降至 06:00（圖三）。這和先前的觀察吻合：TIM 蛋白質表現量在進入天時逐下降如果抑制泛素受體 (ubiquitin receptor) Dsk2/Ubiquilin 表現，會提升 TIM 濃度。因此能推論，泛素化確實調控著 TIM 蛋白質含量。
圖三：TIM蛋白質被泛素化的程度與時間的關係。
圖片來源：Szabó, Á. et al. (2018) Ubiquitylation dynamics of the clock cell proteome and TIMELESS during a circadian cycle. Cell reports, 23(8), 2273-2282
當泛素被接到待降解的蛋白質時，常常不只會連結 1 個泛素分子，而是會接上一連串的泛素。新加上的泛素常會附著於前一個泛素的部離胺酸 (lysine, K) 或者末端的甲硫胺酸 (methionine, M)，催化這過程的眾多酵素們合理地稱為泛素連接酶 (ubiquitin ligase)。特定的泛素連接位置常代表特定的訊息，例如泛素連接到第48號位置的離胺酸 (K-48)是典型的蛋白質體降解訊號。這次研究卻發現 K-48 泛素化在 12:00最顯著，而非在 00:00，這可能是因為 TIM 在正中午最不容易累積。先前發現兩種泛素連接酶，CUL-3、SCFSLMB，被認為和連續黑暗環境裡的 TIM 濃度變化相關，另一種泛素連接酶，SCFJETLAG，則可被光線激發，將 TIM 泛素化。如果使 slmb、Cul-3 基因失效，果蠅的行為會失去節律性。如果同時抑制 slmb、Cul-3 兩者，果蠅部的Ub-TIM 濃度的確會下降。然而 Cul-3 突變不會增減Ub-TIM 、slmb 基因失效反而會增加 Ub-TIM 的濃度。所以這些泛素連接酶的互動與功能仍沒明確的定論。
從這個研究可以窺探真核細胞內訊息傳導的多層次調控，mRNA 被轉譯之後並非什麼事都沒了。泛素化透過直接影響蛋白質含量、間接影響大分子穿越細胞核，最終也會影響到果蠅的日夜行為，因此，轉譯後修飾研究也將為生理時鐘領域帶來更多線索。另外，這篇論文內做了大量的蛋白質電泳與西方墨點法，這告訴我們努力跑整天的膠，雖然辛苦，但總會有回報的！
註：Megator (MTOR)的另外一個名字是Nucleoprotein TPR (TPR)，避免與比較知名的 mTOR (mammalian target of rapamycin)蛋白搞混。
參考文獻
[1] Szabó, Á., Papin, C., Cornu, D., Chélot, E., Lipinszki, Z., Udvardy, A., … & Rouyer, F. (2018). Ubiquitylation dynamics of the clock cell proteome and TIMELESS during a circadian cycle. Cell reports, 23(8), 2273-2282. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.04.064
撰文｜王振宇
審稿｜蕭皓文
