近年來，生物內的生理時鐘 (circadian clock) 被廣泛認為與行為及生理有緊密的關聯，並屬於一種內源性的機制，這樣的內源性機制在不同的細胞類型及組織中也普遍存在 [1]。在免疫細胞中，其功能與基因表現也有類似於生理時鐘的 24 小時震盪，例如：白血球趨化 (leukocyte recruitment) 至其他組織會發生在生物體較為活躍的時期 (active phase)；而在血液循環的白血球數量最高會發生在生物體較為靜止的時期 (resting phase)，顯示免疫細胞的功能也可能會受到晝夜節律的影響 [2]。
目前有許多研究證實老化與許多疾病相關，其中包括因免疫功能失調誘發的相關病徵。 例如：人體對病原菌的抵抗力會隨著老化減弱以及老化導致的免疫細胞發育不平衡。因此，美國史丹佛大學的研究團隊推論老化可能會干擾免疫細胞內的晝夜節律，進而影響免疫細胞的正常功能，最終造成免疫力低下 [3]。
老化影響免疫細胞的晝夜節律
為了證實這個想法，研究團隊以老鼠為實驗模型，首先偵測單核球細胞在不同Zeitgeber (ZT, 註一) 時間點下，年輕鼠 (兩至三個月大) 的和老年鼠 (十八至二十個月大) 的單核球遷移 (monocyte trafficking) 模式 (註二)。結果顯示：年輕鼠單核球細胞會隨著日夜周期不同而有所變化，而老年鼠血液和骨髓中的單核球數量較年輕鼠少，而且對日夜周期變化沒有反應 (圖一)。這樣的差異，也使得老年鼠不利於對抗感染 (圖二)。因此，團隊在不同時間點下對老鼠施打細菌的脂多醣 (lippolysaccharides, LPS)， 誘發其免疫反應後發現：在白天或在晚上施打 LPS 的老年鼠存活率皆沒有差別，而且存活率都低於年輕鼠組別。而在白天施打 LPS 的年輕鼠存活率會優於在晚上施打 LPS 的年輕鼠 (圖二)。
圖一：團隊利用流式細胞儀 (flow cytometry) 偵測Ly6C發炎型單核球細胞在不同Zeitgeber (ZT) 時間點下，年輕鼠和老年鼠的單核球在骨髓、血液和脾臟中的數量變化失去了節律性。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41590-021-01083-0
圖二：相較於年輕鼠，老化的單核球抵抗細菌的能力減弱。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41590-021-01083-0
老化影響巨噬細胞內晝夜節律的基因表現 (rhythmic genes)
為了更進一步了解老化影響免疫細胞的晝夜節律的分子機制，研究團隊透過 RNA 定序 (RNA-seq) 觀察不同時間點年輕鼠和老年鼠整體基因變化。結果發現，老年鼠巨噬細胞內的晝夜節律基因的表現量較年輕鼠低。這個觀察因而萌生出下一個關鍵問題：晝夜節律基因的表現量降低是由什麼造成的？團隊首先猜測可能是因為染色質的開放性差異， 於是研究團隊利用染色質開放性定序技術 (assay for transposase-accessible chromatin sequencing, ATAC-seq) 比較老年鼠及年輕鼠巨噬細胞內染色質開放程度的差異。 實驗結果表示：老年鼠的巨噬細胞中的確有較低的染色質開放性，但經過團隊再更進一步分析後發現晝夜節律基因並不位在具有染色質開放程度差異的位置，顯示老年鼠與年輕鼠的巨噬細胞中晝夜節律基因表現量不同並不是因為染色質開放性差異造成的。
轉錄因子 KLF4 (Kruppel-like factor 4) 可能和免疫力老化有關
若不是生理時鐘分子本身的調控，也並非老化導致染色質開放性差異造成的晝夜節律基因表現，團隊想到了另一可能性：由轉錄因子調控的基因表現。團隊認為需要調控因老化導致巨噬細胞晝夜節律基因表現的轉錄因子須符合三個條件，分別是：(1) 年輕鼠和老年鼠相比的染色質開放性程度。(2) 被轉錄因子所調控的節律基因在兩組別中顯現出節律變化。(3) 原本在年輕鼠組別中有表現的轉錄因子其表現量是否在老年鼠組別中下降。團隊最後認為符合的轉錄因子為：KLF4 (Kruppel-like factor 4)。
為了驗證轉錄因子 KLF4 和免疫力老化有關，研究團隊利用 RNA 干擾 (RNA interference, RNAi) 的技術抑制年輕鼠中 KLF4 的表現，並從中分離出腹膜巨噬細胞。觀察巨噬細胞的吞噬作用 (phagocytosis)，此正是探討巨噬細胞活性的一項重要指標。團隊將分離出的腹膜巨噬細胞加以培養，並加入帶有螢光標記的 E. coli 觀察細胞的吞噬作用。結果發現：KLF4 表現量較低的腹膜巨噬細胞的吞噬作用比控制組低 (圖三a紅色線)，而且對日夜週期的變化沒有反應。這個結果和先前觀察到的現象 ”老年鼠的吞噬作用比年輕鼠差，而且不受日夜週期調控 (圖3b紅色線)”是一致的。
圖三：腹膜巨噬細胞在不同 ZT 時間點(x軸)所觀察到的螢光值 (y軸)。結果顯示老化的巨噬細胞顯示的吞噬作用較年輕鼠弱。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41590-021-01083-0
KLF4 變異可能和人類抗微生物能力下降有關
為了進一步評估 KLF4 在臨床上的應用價值，研究團隊從 UK BioBank 蒐集攜帶 KLF4 遺傳變異的個體，並分析這些個體與細菌感染的關連性。結果發現：(1) 未攜帶 KLF4 遺傳變異的老年組 (超過 65 歲以上) 比起年輕組有較高被病原菌 (E. coli) 感染的風險，然而攜帶 KLF4 遺傳變異的年輕組被病原菌 (E. coli) 感染的風險和老年組相當 (圖四a)。(2) 攜帶 KLF4 遺傳變異的個體容易因細菌感染而有較短的存活曲線 (圖四b,c)，說明 KLF4 的變異確實會影響人類抵抗病原的能力。
圖四：(a)有無攜帶 KLF4 遺傳變異的老年組和年輕組發生大腸桿菌感染的勝算比 (odds ratio)。(b,c) UK BioBank 對攜帶 KLF4 遺傳變異與非攜帶者死於微生物感染的 12 年存活曲線資料。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41590-021-01083-0
結語
這篇研究以老化誘導的免疫功能失調為出發點，探究老化如何影響巨噬細胞功能的節律性。團隊不但證實老化會影響巨噬細胞內具晝夜震盪規律的基因表現，也找出了調控此現象的關鍵轉錄因子：KLF4。此外，團隊也透過分析臨床資料發現：KLF4 確實會影響人類抵抗病原菌的能力，驗證了以 KLF4 為藥物標靶具有臨床上的潛力。雖然老化目前仍被視為不可逆的過程，但透過老化相關研究，相信能為因老化衍生的相關疾病帶來更多的治療線索。
註一：ZT 指的是定時器時間 (Zeitgeber time, ZT) ，這是實驗室環境所訂定的環境時間， ZT0 為白天開始時，或是開燈時間； ZT12 則為夜晚開始時，也就是關燈時間。
註二： 單核球遷移 (monocyte trafficking) 模式可藉由偵測不同時間點單核球在骨髓、血液中和脾臟中的數量來得知。
參考文獻
1. Acosta-Rodríguez, V.A., Rijo-Ferreira, F., Green, C.B. et al. Importance of circadian timing for aging and longevity. Nat Commun 12, 2862 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-22922-6
2. Scheiermann, C., Kunisaki, Y. & Frenette, P. Circadian control of the immune system. Nat Rev Immunol 13, 190–198 (2013). https://doi.org/10.1038/nri3386
3. Blacher, E., Tsai, C., Litichevskiy, L. et al. Aging disrupts circadian gene regulation and function in macrophages. Nat Immunol (2021). https://doi.org/10.1038/s41590-021-01083-0
撰文｜蔡伊婷
審稿｜蕭皓文
