賓夕法尼亞大學 Amita Sehgal 教授和他的研究團隊們們利用黑腹果蠅 (Drosophila melanogaster) 進行實驗，他們將一種化學螢光物質 rhodamine b (RHB) 注入果蠅的體內，發現 RHB 在大腦累積的量會隨著時間而有所不同，因此猜測這一現象可能與日夜節律有關[1]。
延伸閱讀：解構神經系統疾病之謎：利用 iPSCs 作為藥物篩選系統
在研究人員注入 RHB 進到果蠅的胸腔內一小時後，他們將果蠅進行解剖並取出大腦觀察其中的 RHB 螢光含量。他們發現 RHB 在晚上進入到腦中的量會比白天還要多（圖一）。於是猜測果蠅大腦的血腦障壁會隨著日夜節律的變化而通透性會有所不同。為了驗證這一猜想，科學家們利用了失去日夜節律的 per突變的果蠅，同樣的觀察腦中不同時間點的螢光訊號，發現 per突變的果蠅腦中的螢光量就不會隨著時間改變。因此說明了 RHB 隨著時間在腦中量的變化與日夜節律有關。
圖一、不同時間點，RHB在 Wildtype (左側) 與 per (右側) 突變果蠅腦中的螢光亮度所繪製的折線圖。圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.02.017
那麼更細節的分子機制是如何運作的呢？科學家們為了方便進行實驗，他們先地把果蠅腦完整的取出後，浸泡至 RHB 溶液內再快速地觀測。同樣的也發現腦中 RHB 在白天的量比晚上還要多，且在白天的時候，腦中的 RHB 螢光訊號衰弱的速度比晚上還要快，說明在白天的時候 RHB 從腦中排出的速度比較快（圖二）。為了檢測 RHB 的排出機制，因此他們挑選 MDR65 基因突變的果蠅（為人類 pgp同源的運輸蛋白[註一]）進行實驗，發現 mdr65突變體在白天的時候腦中 RHB 的量不會降低。藉此推測夜晚腦中的 RHB 較多、白天的 RHB 較少，，其實應該是因為白天時 RHB 被 pgp 通道蛋白排出去。針對這個假說，他們餵食 pgp 運輸蛋白的抑制劑 varapamil 給正常果蠅，結果也沒有看見 RHB 在白天下降了。所以能知道，pgp 運輸通道蛋白在控制 RHB 隨著日夜節律的變化中佔有重要的角色。
圖二、將果蠅腦取出後放入 RHB溶液中浸泡，拿到顯微鏡底下觀察 RHB螢光，結果顯示在夜晚 (下排，ZT12-16) 腦中的螢光亮度的大於白天(上排，ZT4-8)，且白天螢光訊號在8分鐘內減少的速度大於夜晚。圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.02.017
在果蠅的血腦障壁中有兩種型態的神經膠細胞，分別是 perineural glia (PG)和 subperineural glia (SPG)。透過免疫螢光 (immunofluorescent)染色發現 pgp通道蛋白位在果蠅 SPG 中。那麼在 SPG 中的 pgp 運輸蛋白是如何受到調控而排出腦中的 RHB 呢？研究人員先是在不同時間觀察 pgp的表現量，結果卻顯示其表現量不受時間影響。既然 pgp 表現量恆定，於是研究者們便猜測有其他分子會隨著日夜節律去調控 pgp 的活性。
過去已知鎂離子能夠促進 pgp運輸蛋白的活性 [2]，讓它能將細胞內的分子往外排出。經過實驗證明，研究人員們發現果蠅 SPG 中的鎂離子會受到日夜節律所調控：白天時，SPG中鎂離子多，晚上時則變少。也就是說，鎂離子在白天時能促進 pgp運輸蛋白的活性，讓 RHB排出。至於 SPG中的鎂離子則是受到與 PG之間的隙型連結 (gap junction)影響，科學家們發現在白天的時候，因為隙型連結表現量較少，而這會造成鎂離子累積在SPG中，進而加強 pgp通道蛋白的活性、將腦內的RHB排出。反之在夜晚的時候，因為隙型連結表現量比較高，鎂離子會從 SPG中流到 PG，造成 SPG中的 pgp運輸蛋白活性降低，因此 RHB得以保留在大腦內。
最後作者利用了癲癇的果蠅模式 easily shocked (eas) ，這種果蠅會受到物理性的刺激而引發癲癇。他們分別在白天和晚上餵給果蠅抗癲癇藥物苯妥英 (phenytoin)，發現在晚上的時候，果蠅從癲癇中復原的情況比白天還要來得快，這項原因正是由於在果蠅日夜節律對於血腦障壁通透性的影響，使得藥物比較能被保留在大腦中，進而提高藥效。
研究團隊藉由觀察果蠅大腦與 SPG細胞，發現 SPG的鎂離子、pgp運輸蛋白與連結 PG的隙型連結隨著日夜節律的變化及交互作用，證明了血腦障壁的通透性會受到日夜節律所影響。這項研究首次找到生理時鐘存在於血腦障壁的分子證據，也為未來在施予腦部用藥給疾病動物、病人時，需要考量適合的時間來提高藥效提供科學證據。
註一：pgp (P-glycoprotein 1)通道蛋白是一種耗能的物質幫浦，藉由消耗 ATP將受質排出細胞，其受質多樣，包含許多種藥物、毒素。
參考文獻：
[1] Zhang, S. L., Yue, Z., Arnold, D. M., Artiushin, G., & Sehgal, A. (2018). A Circadian Clock in the Blood-Brain Barrier Regulates Xenobiotic Efflux. Cell, 173(1), 130–139.e10. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.02.017
[2] Booth, C. L., Pulaski, L., Gottesman, M. M., & Pastan, I. (2000). Analysis of the properties of the N-terminal nucleotide-binding domain of human P-glycoprotein. Biochemistry, 39(18), 5518–5526. https://doi.org/10.1021/bi992931x
撰文｜余至傑
審稿｜王振宇
