細胞中的生物鐘是自主性的，並且與每日晝夜和進食週期相互調節，在數千個基因功能及表現產生大約 24 小時的振盪。實驗動物模型和流行病學數據表明，慢性的晝夜節律紊亂會使代謝疾病的風險增加 [1]。許多科學家在不同的物種上發現，由於老化導致睡眠系統的改變，使其晝夜節律性逐漸衰退 [2]，並因此推測晝夜節律喪失調節可能會導致衰老並縮短壽命，引發科學界對晝夜節律、生理代謝與壽命的高度興趣。
美國哥倫比亞大學 Mimi Shirasu-Hiza 博士的團隊利用黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）作為模式生物，除了發現果蠅的免疫功能會隨著晝夜節律波動，近期也投入於探究特定的生理時鐘基因與疾病之間的關聯 [3]
1. 生理時鐘 PER 蛋白與果蠅壽命的關聯
在本篇研究中 [4]，團隊首先發現若將晝夜節律轉錄抑制因子 timeless（tim）或 period（per）進行突變，可以延長雄性果蠅的壽命；相反地，突變晝夜節律轉錄活化因子 cycle（cyc）或 clock（clk），ˊ則會縮短雄性果蠅的壽命 (圖一)。然而，這與經典的利用飲食限制 [5] 來延長壽命不同，因為 tim 突變或 per 突變的果蠅比對照組吃得更多。若限制這些基因突變果蠅的蛋白質攝取，並沒有更延長它們的壽命，且突變的果蠅體內的分子信號變化與飲食限制的分子機轉變化並不相同。因此，團隊將這種因晝夜節律破壞而造成壽命延長的機制，轉向與壽命相關的新陳代謝進行探究。
延伸閱讀：生理時鐘分子的轉譯後修飾 — SUMO 修飾決定 PER2 蛋白的命運
圖一、晝夜節律轉錄抑制因子的缺失延長了雄果蠅的壽命。 (a) 晝夜節律轉錄因子調控與週期震盪的示意圖。（b，c） cyc 突變的雄果蠅壽命較控制組短。c, DN-Clk（dominant-negative clock） 的雄果蠅壽命較控制組短。（d, e） tim 突變和 per 突變的雄果蠅壽命較控制組長。 tim，time； per，period； cyc ，cycle；clk，clock。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41467-020-15617-x
2. 探究 PER 蛋白突變對粒線體代謝的影響
團隊對基因突變的果蠅進行研究後發現： per 突變的雄果蠅吃得更多但比對照組更瘦，並且在整個晝夜週期產生更多的 CO2，顯示其代謝率更高。由於呼吸代謝速率主要是受粒線體的氧化磷酸化影響，因此為了確定增加的氧化磷酸化是否導致 CO2 代謝輸出增加，野生型及 per 突變的果蠅被團隊餵食魚藤酮（粒線體複合物抑制劑），發現和 per 突變的果蠅，其 CO2 並沒有顯著差異，per 突變的果蠅呼吸率仍然高於對照組，說明突變果蠅的呼吸代謝率增加與粒線體 ATP 合成無關，因此團隊推測可能是涉及粒線體解偶聯（mitochondrial uncoupling; 註一, 圖二）。
圖二、細胞中的氧化磷酸化和粒線體解偶聯。
綠色箭頭為葡萄糖和游離脂肪酸代謝成 NADH 和 FADH2，並產生電子（e-），提供給粒線體內膜中的電子傳遞鏈，最終電子被傳輸到氧分子，進一步被還原成水。同時，質子（H+) 不斷從粒線體基質進入粒線體膜間腔，從而建立質子濃度梯度，並驅動 ATP 合成酶 合成 ATP。解偶聯蛋白（UCP）使質子從膜間腔洩漏到粒線體基質，透過消散質子濃度梯度，源自氧化物的能量以熱量的形式釋放。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/nrm1592
3. 粒線體解偶聯藥物延長果蠅壽命與其分子路徑
為了證實他們的假設，團隊進一步餵食野生型及 per 突變的果蠅兩種藥物，分別為 (1) 2,4-dinitrophenol（2,4-DNP）以消除質子濃度梯度和 (2) stearic acid 以活化其內源性解偶聯蛋白（uncoupling proteins；UCP）。團隊發現：經 2,4-DNP 及 stearic acid 處理後， per 突變的果蠅呼吸速率比野生型更快，但這兩種藥物並不會再額外增加 per 突變果蠅的呼吸速率，表示 per 突變足以造成大部分粒線體解偶聯。此外，相對於對照組， per 突變果蠅的粒線體也表現出粒線體解偶聯的相關特徵：洩漏呼吸（leak respiration）增加、膜電位降低、耗氧率增加和產熱增加等，顯示 per 突變會促進粒線體解偶聯。
在證實了週期蛋白 PER 會促進粒線體解偶聯後，團隊也進一步探討這是否與 per 突變造成的壽命延長相關。團隊證實：促進解偶聯的蛋白 UCP4B 及 UCP4C 表現量在 per 突變果蠅內特別高，此外，這兩個蛋白的表現更受到晝夜節律的調控。此外，團隊更發現若將 per 突變的果蠅內 UCP4B 及 UCP4C 表現量下調，會使 per 突變果蠅的解偶聯現象與壽命變得與野生型果蠅無異，顯示 per 突變會透過調控 UCP4B 及 UCP4C 蛋白進而影響果蠅的代謝與壽命。
4. 果蠅腸道 PER 蛋白突變足以延長果蠅壽命
而後團隊也利用基因編輯系統恢復 per 突變的果蠅不同器官系統中 per 的表達量， 他們發現只有在全身性與腸道中過度表達 per，才能使 per 突變的果蠅壽命恢復到對照組的壽命。此外，團隊更證實腸道中 Ucp4C 的表達不僅延長 per 突變果蠅的壽命，而且也足以延長野生型果蠅的壽命。團隊同時證明了因 per 突變或 Ucp4C 表達增加造成的粒線體解偶聯，可以降低腸道中的活性氧物質（reactive oxygen species；ROS）的產量，並抑制與衰老相關的腸道細胞增殖（圖三c, d）。也就是說，若能透過調控腸道特異性的晝夜節律，使得生理功能的震盪與粒線體解偶聯增加，將會有助於壽命的延長。
圖三、腸道特異性的晝夜節律調控粒線體解偶聯與生理現象。
（a，b）分別在白天和晚上使用 Hoechst (DNA) 和 TMRE 染色腸道中的粒線體，野生型腸道在白天表現出高膜電位，而在夜間表現出低膜電位，但 per 突變 的果蠅在兩個時間都表現出低膜電位。（c）腸道中利用有絲分裂細胞的標記物 pHH3+ 染色的定量， per 突變具有較低水平過度增殖，並且 Ucp4C 的過量表達導致有絲分裂細胞大量減少。（d） per 突變和 Ucp4C 過度表達的腸細胞中 ROS 輸出降低。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41467-020-15617-x
最後，團隊也進一步以可以促進粒線體解偶聯化合物 2,4-DNP 和解偶聯劑β-羥基甲苯 （hydroxytoluene, BHT） 進行藥理實驗後發現：這兩種藥物皆可延長野生型果蠅的壽命。且 2,4-DNP 更可減緩腸細胞腫瘤的進展。
結語
生理時鐘的調控、代謝、以及壽命之間的關係相當複雜，而透過上述實驗結果，團隊提出一個非典型的壽命延長機制：腸道中生理時鐘分子 PER 蛋白的缺失可以促進粒線體解偶聯，降低活性氧化物的產量，不但可以維持腸道機能與恆定與避免因老化導致的幹細胞增殖，更可以延長壽命。此外，團隊也利用藥理實驗提出以粒線體解偶聯為標靶的藥物，進而延長野生型果蠅壽命的可能性，為延緩衰老提供一個嶄新的治療觀點。
註一：粒線體解偶聯透過消除粒線體內膜兩側的跨膜質子濃度差，使氧化磷酸化過程與 ATP 的合成減慢，進而產生無效的呼吸循環並產生熱量，如同哺乳動物棕色脂肪一樣。
參考文獻：
1. Shimizu, I., Yoshida, Y. & Minamino, T. A role for circadian clock in metabolic disease. Hypertens Res 39, 483–491 (2016). https://doi.org/10.1038/hr.2016.12
2. Mattis J, Sehgal A. Circadian Rhythms, Sleep, and Disorders of Aging. Trends Endocrinol Metab. 2016 Apr;27(4):192-203. https://doi.org/10.1016/j.tem.2016.02.003
3. https://www.genetics.cuimc.columbia.edu/profile/mimi-shirasu-hiza-phd
4. Ulgherait, M., Chen, A., McAllister, S.F. et al. Circadian regulation of mitochondrial uncoupling and lifespan. Nat Commun 11, 1927 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-15617-x
5. Allen VW, O’Connor RM, Ulgherait M, Zhou CG, Stone EF, Hill VM, Murphy KR, Canman JC, Ja WW, Shirasu-Hiza MM. period-Regulated Feeding Behavior and TOR Signaling Modulate Survival of Infection. Curr Biol. 2016 Jan 25;26(2):184-194. https://doi.org/10.1016/j.cub.2015.11.051.
撰文｜吳佳勳
審稿｜蕭皓文
