細胞界的破壞死光：光感物質選擇性的誘導細胞凋亡

選擇性的細胞去除（cell ablation）在神經及發育生物學是一重要方法，可幫助了解特定細胞在疾病發生、組織再生、個體發育等過程中扮演的角色。這些方法需要能夠永久、有條件的去除指定的細胞，並且盡可能地避免殺死目標以外的細胞以避免干擾觀察。而光學誘導便是一種能精準去除細胞的方式，利用可被特定波長光源活化並產生活性含氧物（reactive oxidative species, ROS）的光感物質（photosensitizer）來誘導細胞凋亡，便能夠在精確的時間與空間控制下，去除含有這些光感物質的細胞，大幅減少非專一性的細胞殺傷 [1]。過去科學家們已開發出具有紅色螢光的 KillerRed 與綠色螢光的 miniSOG 等活性含氧物生成蛋白 [2] [3]。除了大分子的蛋白外，小分子的光感物質也具有選擇性細胞去除的潛力，它們通常具有更強的光毒性，且相較大分子，細胞能容納更多小分子。

東京大學的浦野泰照教授長期專注於開發具有光學活性的功能性小分子，以團隊先前開發的 HMDESeR-βGal 為基礎 [4]，發表這個名為 SPiDER-killer-βGal 的光感小分子 [5]，其具有無色、無光毒性、可穿透細胞膜的特性，當 SPiDER-killer-βGal 被 β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）水解切除 β-半乳糖後，親核基（nucleophile，如細胞內的蛋白質）能經由親核性攻擊（nucleophilic attck）與之相接（圖二 A），吸收光譜因化學結構改變隨之變化（圖二 B），在特定波長光照下也能產生具光毒性的單重態氧（singlet oxygen）。這樣的設計使得 SPiDER-killer-βGal 能夠選擇性地殺死表現 β-半乳糖苷酶的特定細胞，且由於和蛋白質等大分子結合而被限制在細胞內，避免影響周圍細胞，光照則作為啟動細胞去除的控制方式。

團隊分別在體外共培養、組織實驗、體內實驗中陸續驗證其選擇性細胞去除的效果。在體外共培養實驗中，會表現 β-半乳糖苷酶的 HEK/ lacZ（+）細胞和 HEK293 細胞被分別以藍色及綠色螢光染色，在與 SPiDER-killer-βGal 共培養並照射波長 561 nm 的雷射光後，藍色的 HEK/ lacZ（+）細胞中的光感物質會被活化，使細胞逐漸邁向凋亡，形成小泡（bleb）隨後收縮和破裂。

在組織實驗中則是使用黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）三齡幼蟲的 en-lacZ 翅盤（wing discs，未來成蟲胸部上皮的一部分及翅膀）組織進行培養，由於 β-半乳糖苷酶僅在後側表現，添加 SPiDER-killer-βGal 培養並以 550 nm 的氙燈照射後，以綠色螢光染色只看到組織後側以外的細胞，表示這些表現 β-半乳糖苷酶的細胞被選擇性的誘導細胞凋亡。最後在體內實驗中，透過熱休克（heat-shock）處理使果蠅蛹胸部背側（Drosophila pupal notum）的上皮細胞表現 β-半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白及細胞凋亡報導基因（reporter gene），加入 SPiDER-killer-βGal 並對細胞核進行藍色螢光染色後，再以 561 nm 雷射照射，可以觀察到代表凋亡的紅色螢光陸續在有表現 β-半乳糖苷酶的綠色細胞中出現，且細胞開始碎片化。

這些實驗證實 SPiDER-killer-βGal 能夠被酵素轉化為強力的光感物質，並且藉由與細胞內的蛋白質等親核基反應駐留在細胞內不再擴散至周邊細胞，僅在適當光源的誘導下選擇性的殺死表達 β-半乳糖苷酶的目標。作為一種細胞去除的工具，未來有望應用在研究腦神經或胚胎等複雜網絡中個別細胞的功能，或是做為腫瘤專一性光動力療法（photodynamic therapy）的候選藥物。

 

Main Article:
Chiba, M., Kamiya, M., Tsuda-Sakurai, K., Fujisawa, Y., Kosakamoto, H., Kojima, R., Miura, M., & Urano, Y. (2019). Activatable Photosensitizer for Targeted Ablation of lacZ-Positive Cells with Single-Cell Resolution. ACS central science, 5(10), 1676–1681. https://doi.org/10.1021/acscentsci.9b00678

參考文獻：

1. Liu, F., Dai, S., Feng, D., Peng, X., Qin, Z., Kearns, A. C., Huang, W., Chen, Y., Ergün, S., Wang, H., Rappaport, J., Bryda, E. C., Chandrasekhar, A., Aktas, B., Hu, H., Chang, S. L., Gao, B., & Qin, X. (2019). Versatile cell ablation tools and their applications to study loss of cell functions. Cellular and molecular life sciences : CMLS, 76(23), 4725–4743. https://doi.org/10.1007/s00018-019-03243-w
2. Kobayashi, J., Shidara, H., Morisawa, Y., Kawakami, M., Tanahashi, Y., Hotta, K., & Oka, K. (2013). A method for selective ablation of neurons in C. elegans using the phototoxic fluorescent protein, KillerRed. Neuroscience letters, 548, 261–264. https://doi.org/10.1016/j.neulet.2013.05.053
3. Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., & Jin, Y. (2012). Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 109(19), 7499–7504. https://doi.org/10.1073/pnas.1204096109
4. Ichikawa, Y.; Kamiya, M.; Obata, F.; Miura, M.; Terai, T.; Komatsu, T.; Ueno, T.; Hanaoka, K.; Nagano, T.; Urano, Y. Selective ablation of β-galactosidase-expressing cells with a rationally designed activatable photosensitizer. Angew. Chem., Int. Ed. 2014,  53,  6772– 6775. https://doi.org/10.1002/anie.201403221
5. Chiba, M., Kamiya, M., Tsuda-Sakurai, K., Fujisawa, Y., Kosakamoto, H., Kojima, R., Miura, M., & Urano, Y. (2019). Activatable Photosensitizer for Targeted Ablation of lacZ-Positive Cells with Single-Cell Resolution. ACS central science, 5(10), 1676–1681. https://doi.org/10.1021/acscentsci.9b00678

撰文｜葉國掄
審稿｜黃云宣