病毒在 COVID-19 肆虐全球的當下是個相當熱門的話題。病毒顆粒（virion）為病毒主要功能的載體，對於其作用和組成的進一步認識歸功於各種顯微技術的發展，然而目前顯微技術的挑戰之一為取得單株病毒上病毒顆粒的化學組成或化學特徵的資訊。
干涉式顯微鏡（interferometric microscopy）因其高解析度以及高靈敏度的特性常被用於觀測奈米級的樣本 [1]，然而只能提供和分子親和力相關的分子資訊，其他資訊如病毒顆粒的化學組成等依然無法被測得。所幸，利用拉曼散射光譜（Raman scattering spectroscopy）和紅外光吸收光譜（infrared absorption spectroscopy），我們可以透過量測分子震盪指紋（molecular vibrational fingerprints）來辨別觀測物的化學組成。但是，拉曼散射顯微鏡有截面過小無法直接觀測病毒的問題；而基於紅外光吸收光譜的兩項技術：傅立葉轉換紅外光顯微鏡（Fourier-transform infrared microscopy, FTIR microscopy）和原子力紅外顯微鏡（atomic force microscopy-infrared microscopy, AFM-IR）則分別有低空間解析度和可能因為探針接觸樣本而損壞樣本的問題。
中紅外光光熱顯微鏡（mid-infrared photothermal microscopy, MIP）是一種非接觸式且可以達到次微米等級解析度的顯微技術，近期在生醫影像領域備受矚目 [2]。本文 [3] 作者用干涉散射的原理加上共軛焦顯微鏡結構來提升中紅外光光熱顯微鏡的敏感度，使其能夠測到單一病毒結構中化學鍵的指紋區震盪光譜（vibrational fingerprint spectra），並能夠依此區分單株痘病毒（poxvirus，以下稱 pox 病毒）和水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）。
共軛焦干涉式中紅外光光熱顯微鏡的結構和運作方式如圖一所示，首先，由水浸物鏡（water immersion objective lens, OJ）聚焦在樣本上的綠光雷射會先產生一個干涉光譜。電腦會依此控制平台位置直到找到最大干涉對比（interferometric contrast），藉此定位觀測目標的位置。接著，由量子級聯雷射器（quantum cascade laser, QCL）所產生的中紅外光波段雷射光，先透過一個氟化鈣玻璃罩再由一個反射物鏡（reflective objective, RO）聚焦在樣本上，同時，裝置中使用碲化汞鎘（mercury cadmium telluride，MCT）感測器量測反射的 IR 雷射幫浦能量，進而對使用不同波數中紅外光時的光熱影像進行標準化。由於觀測物中的分子會因為吸收中紅外光而震盪、升溫、膨脹，進而改變折射率，導致 PD 所捕捉到的散射光場隨之改變。透過量測這樣的訊號變化，可以產生中紅外光光熱影像，同時又因為單一分子中不同鍵結共振頻率的不同，甚至可以觀察其頻譜進而辨別不同的分子。鎖相放大器（lock-in amplifier, LIA）的功能為將 PD 所捕捉到經過調變後的信號解調變（demodulate）出在中紅外光指紋區頻段的光熱訊號，進而產生 MIP 影像。
圖一、共軛焦干涉式中紅外光光熱顯微鏡裝置圖及運作原理圖。
圖片來源：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c05333
在觀測病毒之前，研究團隊先對直徑 200 奈米的 PMMA 顆粒進行觀測，並以此評估共軛焦干涉式中紅外光光熱顯微鏡的表現（圖二）。選用 PMMA 作為奈米顆粒材料的原因為其介電係數和病毒相近，而奈米顆粒的介電係數與所量測到的散射光場有關。由 PMMA 的 MIP 光譜（圖二 e）可以看出，當照射的中紅外光波數為碳氧雙鍵的共振頻率 1729 cm−1 時，MIP 影像的峰值訊號最強，因此可以獲得最清晰的 MIP 影像（圖二 b）。透過 MIP 光譜可觀察到不同鍵結會有不同共振頻率的特性，樣本的化學組成也得以判別。
圖二、共軛焦干涉式中紅外光光熱顯微鏡量測 200 奈米 PMMA 粒子的結果。（a）定位用的干涉影像（b）以波數為 1729 cm−1 的中紅外光照射後的 MIP 影像。1729 cm−1 為碳氧雙鍵的共振峰值（e）PMMA 的中紅外光光譜。其中亦可見一個碳氫單鍵的共振峰值，意味著可由透過 MIP 光譜了解觀測物顆粒的化學組成。
圖片來源：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c05333
在鑑測了共軛焦干涉式中紅外光光熱顯微鏡的高解析度與辨識觀測物例子化學組成的能力後，接著則探討此技術利用 MIP 影像及光譜辨識及區別單一病毒的潛力，並以 pox 病毒與 VSV 進行測試。以 1550 cm−1 及 1650 cm−1 波數中紅外光照射 pox 病毒時所得的 MIP 影像（圖三 b），透過 LIA 從干涉式散射影像（圖三 a）分離出中紅外光頻段訊號，而此二波段分別為 I-醯胺和 II-醯胺結構的共振頻率（圖三 d）。這兩個峰值可以作為 pox 病毒 MIP 光譜的特徵，以幫助科學家辨識病毒種類或其他病毒進行區隔。
圖三、單株痘病毒（poxvirus）的干涉影像和 MIP 影像以及多株痘病毒 MIP 光譜的比較。（a）pox 病毒的干涉影像（b）為 pox 病毒在照以 1550 cm−1 及 1650 cm−1 波數中紅外光時的 MIP 影像（c）此二波段分別為 I-醯胺和 II-醯胺結構的共振頻率。
圖片來源：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c05333
團隊後續亦以相似的方法分析 VSV 的 MIP 影像及其光譜。進一步比較 pox 病毒（圖三 d）和 VSV（圖四 c）的 MIP 光譜可知，兩者都具有 I-醯胺和 II-醯胺共振頻率的峰值，但其數值卻不相同［註一］。綜合上述結果，共軛焦干涉式中紅外光光熱顯微鏡所產生的 MIP 光譜，不只可以幫助我們了解病毒顆粒的化學組成，還有能力透過 MIP 光譜的差異來分辨不同病毒的不同化學組成，進一步區別不同的病毒種類。
圖四、單株水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus）的干涉影像、MIP 影像以及多株 VSV 病毒之間 MIP 光譜和 pox 病毒 MIP 光譜之間的比較。（a）VSV 干涉影像（b）在 I-醯胺的共振頻率時的 MIP 影像（c）為兩株 VSV 病毒的 MIP 光譜，可見所觀測到的光譜是可重複的（d）pox 病毒和 VSV 病毒的光譜在以 I-醯胺的 MIP 訊號強度為底標準化後的結果。
圖片來源：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c05333
註一：為對 pox 病毒以及水疱性口炎病毒的 MIP 信號進行比較，圖四（d）中的光譜均以各自 I-醯胺共振頻率的峰值為底做標準化（normalization）。
Main Article:
Zhang, Y., Yurdakul, C., Devaux, A. J., Wang, L., Xu, X. G., Connor, J. H., … & Cheng, J. X. (2021). Vibrational spectroscopic detection of a single virus by mid-infrared photothermal microscopy. Analytical Chemistry, 93(8), 4100-4107. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.0c05333
參考文獻：
[1] Taylor, R. W., Mahmoodabadi, R. G., Rauschenberger, V., Giessl, A., Schambony, A., & Sandoghdar, V. (2019). Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics, 13(7), 480-487.
[2] Li, C., Zhang, D., Slipchenko, M. N., & Cheng, J. X. (2017). Mid-infrared photothermal imaging of active pharmaceutical ingredients at submicrometer spatial resolution. Analytical chemistry, 89(9), 4863-4867.
[3] Zhang, Y., Yurdakul, C., Devaux, A. J., Wang, L., Xu, X. G., Connor, J. H., … & Cheng, J. X. (2021). Vibrational spectroscopic detection of a single virus by mid-infrared photothermal microscopy. Analytical Chemistry, 93(8), 4100-4107.
撰文｜林鈺翔
審稿｜陳品萱、黃云宣
