在醫療、生理、病理等領域的研究中，探究細胞的訊息傳遞途徑是相當重要的環節。其中，細胞藉由細胞膜上的受體接收外來訊號是研究中經常會涵蓋的範圍。受體的蛋白質奈米環境（protein nanoenvironment，意指「受體周圍的蛋白質組成與其空間分布」）經研究指出與受體功能的發揮息息相關 [1]。過去的科學家曾利用超高解析度顯微鏡學（super-resolution microscopy），透過偵測螢光分析受體
的蛋白質奈米環境，但往往受限於同時間所能偵測到的蛋白質數量 [2]。受到將 DNA 定序技術應用於 DNA 影像學研究的啟發，在這篇來自瑞典卡羅琳學院（Karolinska Institutet）的研究中，作者透過 DNA 定序的方式試圖辨認膜蛋白的在奈米級下的空間分布，將此方法命名為 NanoDeep（全名：nanoscale deciphering of membrane protein nanodomains），並進一步透過 NanoDeep 分析 Her2 受體（human epidermal growth factor receptor 2，Her2）的蛋白質微環境，驗證其應用價值 [3]。
執行 NanoDeep 的過程需要一個名為 NanoComb 的 DNA 奈米組裝分子（DNA nanoassembly）。NanoComb 是由一個雙股 DNA 骨架加上名為 prong 的單股寡核苷酸（single-stranded DNA oligonucleotide）凸出結構所共同組成。一個 NanoComb 上含有一個 reference prong（以下以「參考耙」代稱）和四個 detection prongs（以下以「偵測耙」代稱）。參考耙和偵測耙皆由空白區段（spacer）、限制酶辨認位點（restriction enzyme recognition site）、位置條碼（position barcode）以及結合區（binding region）所組成（圖一）。參考耙會事先接上能辨認目標蛋白的結合劑（binder，註一），偵測耙則是會與結合劑庫（binder library）中能與其配對的結合劑透過混成作用（hybridization，註二）相接。最後，透過聚合酶與限制酶的作用取得雙股DNA片段之後，經由次世代定序法（next-generation sequencing，NGS）便可得到目標蛋白周邊關於蛋白質微環境的資訊（圖二）。
圖一、NanoComb 中 prong 與 binder 的序列結構。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41565-020-00785-0
圖二、NanoComb 結構以及 NanoDeep 的執行步驟。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41565-020-00785-0
完成 NanoDeep 方法學的建立之後，作者進一步針對 Her2 受體高表現的乳癌細胞 SKBR3 和低表現的乳癌細胞 MCF7，分析 Her2 受體（human epidermal growth factor receptor 2，Her2）的蛋白質微環境，希望能驗證過去研究所提出的「Her2 的過度表達會增加其與其他 EGFR（epidermal growth factor receptor）家族成員之間的交互作用」這項論述。作者發現：與 MCF7 相較，在 SKBR3 細胞環境下偵測到的 Her2、Her3、EGFR 等蛋白數量明顯較高，證實 Her2 過度表達與提高交互作用之間的相關性。此外，當細胞膜上的 Her2 和 Her3 受體因與配體（ligand）的結合而合併成異源二聚體（heterodimer）時， NanoComb 會偵測到較多 Her2 和 Her3 受體，由此可知 NanoDeep 有能力識別不同細胞狀態下的膜蛋白變化。作者最後同時針對 Her2、Her3、EGFR、CD63、integrin α5β1 以及 CD71 等六個蛋白利用結合劑進行標靶，發現偵測結果會因參考耙針對的蛋白而有所不同。例如：Her2-NanoComb 可偵測到 Her2、Her3、EGFR、CD63 和 integrin α5β1；CD71-NanoComb 只能偵測到 CD71 和低含量的 CD63 和 integrin α5β1。這項實驗證實透過擴大結合劑庫中的結合劑類型，NanoDeep 可針對參考蛋白周圍的多種蛋白同時進行分析。
NanoDeep 得以在一定空間範圍內，針對細胞群的表面提供高解析度的資訊，而前文提及的超高解析度顯微鏡學則是可針對單一細胞的奈米環境提供即時影像，兩者相輔相成。若能將這兩項技術互相搭配，無非能成為細胞相關研究上的利器。
[註一] 結合劑是由親和抗體分子（affibody）與寡核甘酸共同組成的複合物。
[註二] 混成作用指的是先利用阻擋股（blocking strand）擋住結合劑的結合區，當結合劑與目標蛋白結合之後，透過立足點置換方法（toehold-mediated displacement）加入入侵股（invading strand），使入侵股與阻擋股結合。入侵股會將阻擋股帶離結合劑的結合區，使結合劑的結合區裸露，結合劑便可以與NanoComb偵測耙相接。
Main Article:
Ambrosetti, E., Bernardinelli, G., Hoffecker, I., Hartmanis, L., Kiriako, G., de Marco, A., Sandberg, R., Högberg, B., & Teixeira, A. I. (2021). A DNA-nanoassembly-based approach to map membrane protein nanoenvironments. Nature nanotechnology, 16(1), 85–95.
https://doi.org/10.1038/s41565-020-00785-0
參考文獻：
[1] Bethani, I., Skånland, S. S., Dikic, I., & Acker-Palmer, A. (2010). Spatial organization of transmembrane receptor signalling. The EMBO journal, 29(16), 2677–2688.
https://doi.org/10.1038/emboj.2010.175
[2] Galbraith, C. G., & Galbraith, J. A. (2011). Super-resolution microscopy at a glance. Journal of cell science, 124(Pt 10), 1607–1611. https://doi.org/10.1242/jcs.080085
[3] Ambrosetti, E., Bernardinelli, G., Hoffecker, I., Hartmanis, L., Kiriako, G., de Marco, A., Sandberg, R., Högberg, B., & Teixeira, A. I. (2021). A DNA-nanoassembly-based approach to map membrane protein nanoenvironments. Nature nanotechnology, 16(1), 85–95.
https://doi.org/10.1038/s41565-020-00785-0
關鍵字：protein nanoenvironment, DNA assembly
撰文｜張芷榕
審稿｜李柏萬
