細胞牽引機：以肌凝蛋白為基礎建立的細胞脂質奈米管拖動平台

分子馬達（molecular motor）為一種在生物體中負責細胞運輸、能量代謝及細胞分裂等行為的蛋白質統稱，對生物體的維持非常重要，較常見的分子馬達像是肌動蛋白（actin）、肌凝蛋白（myosin）及驅動蛋白（kinesin）等可透過水解 ATP 獲取能量來達到物理上的分子移動 [1][2]。在細胞膜相關的研究中，科學家已開發出許多方法來研究細胞膜和周圍環境間的生物物理現象，但仍舊缺乏較為直觀的工具來探討其動態行為。有鑑於此，來自德國馬克斯普朗克醫學研究所的 Kerstin Göpfrich 教授團隊便利用肌凝蛋白建立一個用於拖動脂質奈米管（lipid nanotube）的微型平台來探討細胞膜與周遭環境的交互作用 [3]。

為了主動性的使細胞脂質奈米管形成並活動，團隊首先建立可用於研究肌動蛋白與肌凝蛋白交互作用的體外移動試驗（in vitro motility assay）平台（圖一），利用重酶解肌凝蛋白（heavy meromyosin, HMM）修飾基質表面並加入未聚合的肌動蛋白纖維，可水解 ATP 並達到表面分子移動的效果，平台表面可依據排列情形分成隨機與整齊兩種並用於之後的實驗中。

圖一、經 HMM 與肌動蛋白修飾過的基質表面。
圖片來源：https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.1c04254

在建立實驗平台後，研究團隊使用巨型單層囊泡（giant unilamellar vesicles, GUVs）及活細胞兩種模式來觀察脂質奈米管的活動。在 GUVs 模式中，他們添加含有生物素（biotin）修飾的肌動蛋白單體到平台中並製備了部分具生物素修飾脂質的 GUVs 作為實驗模式，由於卵白素（streptavidin）和生物素具專一性結合的關係，因此在卵白素存在下可讓 GUVs 和肌動蛋白連接，使脂質奈米管形成並在平台上拉動。實驗結果顯示，由於分子馬達的活動，脂質奈米管隨時間不斷地從 GUVs 中被拉出，在經過 37.5 秒後其長度可達 30 μm，而在隨機與整齊排列的平台中，無論有無經生物素修飾，脂質奈米管長度在整齊排列環境下皆比隨機排列要高，若經生物素修飾，脂質奈米管的網狀結構也會一併增加（圖二）。值得一提的是，為了確認脂質奈米管有無缺陷，研究人員包覆染料 Alexa Fluor 647 到 GUVs 中並發現隨著脂質奈米管被拉動，染料也會移動到奈米管，證實了奈米管結構的完整性。此實驗成功在 GUVs 模式下拖動脂質奈米管，使利用分子馬達控制囊泡型態有一定的可行性。

圖二、GUVs 模式下肌動蛋白纖維拖動脂質奈米管。(a)體外移動實驗示意圖。(b)脂質奈米管網狀結構長度比較。(c) 脂質奈米管拖動的細胞影像。
圖片來源：https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.1c04254

在活細胞模式中，研究團隊使用 T 細胞（Jurkat 細胞）作為實驗對象，由於 Jurkat 細胞為懸浮型細胞，因此實驗前須將具生物素修飾的膽固醇（cholesterol）自組裝到細胞膜表面，使細胞能夠和平台連接以利後續觀察。實驗結果和 GUVs 模式相似（圖三），處於整齊排列環境下的脂質奈米管被拖動的距離明顯大於隨機排列的環境，證實可從活細胞模式中成功拖動脂質奈米管；與較為簡單的 GUVs 模式不同，在活細胞實驗中，Jurkat 細胞的胞器像是粒線體等並未在脂質奈米管被拖動後隨之進入，而細胞本身的肌動蛋白也僅出現在奈米管前段區域，推測可能是因為外部拖動脂質奈米管的距離過長及其產生的應力使細胞肌動蛋白被干擾所造成。

圖三、Jurkat 細胞的脂質奈米管拖動情形。(a)不同平台上的細胞影像。(b)脂質奈米管長度比較。(c) 脂質奈米管與細胞自身肌動蛋白的分布情形。
圖片來源：https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.1c04254

在成功於活細胞模式下拖動脂質奈米管後，研究團隊便比較不同貼附類型的細胞在同一實驗模式下的反應及奈米管型態（圖四）。結果顯示半貼附型細胞（巨噬細胞 J774A.1）與懸浮型細胞（Jurkat）明顯產生脂質奈米管，而貼附型細胞（角質細胞 HaCaT 和纖維母細胞 NIH 3T3）並沒有奈米管的產生，原因可能為貼附型細胞和基質表面的附著力量較強所以外部拖動脂質奈米管的作用力無法干擾所致，為了驗證此一說法，研究人員使用肌動蛋白聚合抑制劑（Latrunculin A, LatA）對纖維母細胞進行處理後再進行實驗，結果顯示細胞開始出現脂質奈米管且其網狀結構大小超過 Jurkat 細胞，推測可能為細胞本身大小造成的。此實驗證實外部作用力對脂質奈米管的拖動會受到細胞本身的貼附能力影響而有不同的表現。

圖四、不同細胞的脂質奈米管拖動情形。(a)細胞影像圖。(b) 脂質奈米管網狀結構長度比較。(c)使用肌動蛋白抑制劑處理後的細胞影像與脂質奈米管長度量測(d)。
圖片來源：https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.1c04254

細胞膜與外部環境間的交互作用對細胞的型態、移動行為甚至力學傳導是非常重要的，而此團隊成功建立了一個由馬達蛋白組成的體外移動試驗平台並在 GUVs 及活細胞模式下用於拖動脂質奈米管並觀察不同類型細胞的動態行為，此平台提供了一個良好的工具用於研究細胞膜上的各種現象，對解答生物物理學上的各種問題有非常大的幫助。

Main Article:

Jahnke, K., Maurer, S. J., Weber, C., Bücher, J. E. H., Schoenit, A., D’Este, E., Cavalcanti-Adam, E. A., & Göpfrich, K. (2022). Actomyosin-Assisted Pulling of Lipid Nanotubes from Lipid Vesicles and Cells. Nano Letters, 22(3), 1145–1150. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.1c04254

參考文獻：

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Morgan, D., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2015). Molecular Biology of the Cell. Taylor & Francis.
Hwang, W., & Lang, M. J. (2009). Mechanical Design of Translocating Motor Proteins. Cell Biochemistry and Biophysics, 54(1–3), 11–22. https://doi.org/10.1007/s12013-009-9049-4
Jahnke, K., Maurer, S. J., Weber, C., Bücher, J. E. H., Schoenit, A., D’Este, E., Cavalcanti-Adam, E. A., & Göpfrich, K. (2022). Actomyosin-Assisted Pulling of Lipid Nanotubes from Lipid Vesicles and Cells. Nano Letters, 22(3), 1145–1150. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.1c04254