CRISPR-Cas9 的研究熱浪
CRISPR 基因編輯技術自 2012 年問世以來，可說是在科學界掀起了一場全球性的革命，世界各地的紛紛以 CRISPR-Cas9 基因編輯技術進行各項生物科學的創新應用。利用 gRNA（guide RNA）辨識雙股 DNA 序列， 指引 Cas9 核酸內切酶切割 DNA，故此只需設計與目標 DNA互補的 gRNA變 Cas9 的專一性，不僅提高了基因編輯的效率，也大幅降低設計門檻與製作成本。
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如今短短 10 年的研究熱潮期間，CRISPR-Cas9 系統在臨床治療的發展也有相當大的進展，包括癌症、病毒潛伏性感染與神經退化性疾病等治療，在遺傳疾病的診治更是有不少振奮人心的案例，包括利用 CRISPR-Cas9 在體外（ex vivo）修正 β-地中海貧血（β-thalassemia）或鐮刀型血球貧血症（sickle cell anemia）患者自體的造血幹細胞，並將帶有正常血紅蛋白基因的造血幹細胞注射回患者體內 [1]。然而，注射細胞之前，需使用強烈的化學治療清除原本骨髓內的造血幹細胞，額外的化學治療造成嚴重副作用，這與目前許多疾病治療都面臨相同的困境。體外的基因編輯也不能一次完成治療，或是必須透過長期且持續不間斷的服用藥物，因此若能在體內（in vivo）直接進行基因編輯將提供更有效率的治療選擇。
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體內 CRISPR-Cas9 基因編輯的開拓者：ATTR 蛋白澱粉樣變性疾病
轉甲狀腺素蛋白澱粉樣變性疾病（transthyretin amyloidosis，ATTR）是由於transthyretin（TTR）蛋白的編碼基因 TTR 突變，使蛋白從正常的四聚體解離成單體，並造成錯誤折疊和聚集成澱粉樣蛋白原纖維（amyloid fibrils），進而導致心肌變或多發性神經疾病 [2]（圖一）。目前針對 ATTR 的治療策略包含穩定 TTR 四聚體，或降解 TTR mRNA 進而抑制合成 TTR 蛋白 [3]。雖然可以成功減輕症狀，但需終生服用藥物而且可能產生嚴重副作用，因此需要開發一次到位的治療方法。
圖一、ATTR 蛋白澱粉樣變性疾病之病理機制。Transthyretin（TTR）蛋白在肝臟、大腦及視網膜中合成，負責將甲狀腺素（Tetraiodothyronine，T4）和視黃醇（retinol）經由血漿和腦脊液運送至全身各個器官組織。不正常折疊的單體聚成澱粉樣蛋白原纖維，造成各種器官功能障礙。（圖片來源：https://doi.org/10.1007/s11897-020-00457-z）
以 CRISPR-Cas9 基因編輯技術榮獲 2020 年諾貝爾化學得主之一的珍妮佛．道納（Jennifer Doudna），與美國 Regeneron 生技公司共同創立 Intellia Therapeutics 生技公司，並於 2020 年與倫敦大學國家澱粉樣變性中心合作，使用體內 CRISPR-Cas9 基因編輯治療 ATTR 蛋白澱粉樣變性疾病 [4]。這個 CRISPR 藥物，NTLA-2001，可剔除 TTR 蛋白的兩個對偶基因，降低血清中的 TTR 蛋白含量。
NTLA-2001 含有脂質奈米顆粒（lipid nanoparticle），脂質顆粒包覆著針對 TTR 蛋白基因的單一 gRNA 和 編碼 Cas9 蛋的 mRNA，透過靜脈注射進入患者體內，最終被肝臟細胞攝取（圖二 A）。前期體外試驗發現，NTLA-2001 造成肝細胞的 TTR 蛋白表現量減少超過 95%。進一步在食蟹猴的動物試驗中，給予 Cyn-LNP（NTLA-2001 的非人類靈長類替代物）後，血清 TTR 蛋白量降低幅度超過九成並維持 12 個月（圖二 B），而且無副作用產生。在人體臨床試驗中，6 名患者接受 NTLA-2001 的治療後第 28 天，低劑量組（0.1 mg/kg）的血清內 TTR 蛋白濃度降低約 50%（圖二 C），而高劑量組（0.3 mg/kg）甚至降低大約 80% （圖二 D），並且接受治療期間與治療後都沒發生嚴重的不良反應 [4]。這項試驗表明使用 NTLA-2001 可以降低血清中 TTR 蛋白的濃度，且效果顯著、可能夠持久，說明利用體內 CRISPR-Cas9 基因編輯治療 ATTR 澱粉樣變性疾病，極具治療潛力。
圖二、NTLA-2001的試驗結果。A，NTLA-2001 的主要組成與策略。B，食蟹猴接受 Cyn-LNP 治療的結果 。C，低劑量 NTLA-2001 治療下，血清 TTR 的濃度變化。D，高劑量 NTLA-2001治療下，血清 TTR 的濃度變化。（圖片來源：https://doi.org/10.1056/NEJMoa2107454）
邁入體內基因編輯的新世代
美國 Editas Medicine 開發的 EDIT-101 療法也利用 CRISPR-Cas9 修正造成傳性網膜疾病（Leber congenital amaurosis type 10，患者通常早期失明） 的 CEP290 基因突變 [5]。EDIT-101 由腺相關病毒（adeno-associated virus）做載體，直接注射到視網膜下，病毒可表現 Cas9 和兩個 gRNA，可以去除 CEP290 基因的 IVS26 突變 ，修復視網膜的感光功能。EDIT-101 已在小鼠模式證明可行，人體臨床試驗也在今年 4 月收案。其他疾病也都有在動物實驗提出在體內利用 CRISPR-Cas9 基因編輯的可能性，包括裘馨氏肌肉失養症（Duchenne Muscular Dystrophy）與視網膜色素病變（ Retinitis Pigmentosa）等，顯示出 CRISPR 基因編輯療法已進入新紀元，期許未來能夠以藥劑的形式，將 CRISPR-Cas9 基因編輯器包裹在膠囊內或脂質奈米顆粒中，讓患者可以透過口服或靜脈注射的方式，直接在體內編輯基因，為更多罕見疾病提供更簡便且一勞永逸的治療方法。
延伸閱讀｜
CRISPR/Cas9 於活體基因編輯的新突破能恢復視覺受損老鼠部分視力
當裘馨氏肌肉失養症遇見基因編輯
Main Article:
Gillmore, J. D. et al. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. N Engl J Med 385, 493-502, doi:10.1056/NEJMoa2107454 (2021).
參考文獻：
- Frangoul, H. et al. CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and beta-Thalassemia. N Engl J Med 384, 252-260, doi:10.1056/NEJMoa2031054 (2021).
- Liz, M. A. et al. A Narrative Review of the Role of Transthyretin in Health and Disease. Neurol Ther 9, 395-402, doi:10.1007/s40120-020-00217-0 (2020).
- Gertz, M. A., Mauermann, M. L., Grogan, M. & Coelho, T. Advances in the treatment of hereditary transthyretin amyloidosis: A review. Brain Behav 9, e01371, doi:10.1002/brb3.1371 (2019).
- Gillmore, J. D. et al. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. N Engl J Med 385, 493-502, doi:10.1056/NEJMoa2107454 (2021).
- Maeder, M. L. et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nat Med 25, 229-233, doi:10.1038/s41591-018-0327-9 (2019).
關鍵字：CRISPR、基因與基因體學、遺傳學
撰文｜吳佳勳
審稿｜王振宇
