2008 年諾貝爾化學獎的綠色螢光蛋白，由於可以經由分子生物工程設計後，標記特定的細胞內目標分子，並當給定一個激發光能量後，可以放出較長波長的放射光，因此能透過偵測放射光強度，用於目標分子的定量分析。由於螢光光譜技術相較於其他光譜技術，具有敏感度高、操作較為容易、可用於活體動態監測等優勢，使得各式各樣不同的螢光蛋白可被廣泛的應用於細胞生物學與細胞訊息傳遞路徑的研究當中。
圖一、螢光光譜儀光路示意圖。
圖片來源：https://doi.org/10.1002/cjce.23506
其中一項螢光蛋白的應用是基因編碼的螢光生物感測器（genetically encoded fluorescent biosensor）。生物感測器是一種透過分子工程設計的蛋白質，可以被表現於細胞內，用於偵測細胞內目標分子的濃度、表現量、活性或位置，並將其轉換成螢光訊號 [1]。一個 biosensor 包含感測元件（sensing unit）與報導元件（reporting unit，通常為螢光蛋白）。當目標分子活性或濃度改變時，感測元件的構形會發生改變，進而改變報導元件的螢光強度或光譜。一般的生物感測器除了單螢光蛋白的設計之外，也有以雙螢光蛋白基於螢光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）的設計 （圖二）[2]。
圖二、四種基於 FRET 的生物感測器設計。（a）分離的兩個感測元件（sensory domain + substrate）與目標訊息分子結合，使得兩個螢光基團靠近而產生 FRET 效應。（b）原理與（a）類似，但兩個感測元件互相連結成為一個蛋白質。（c）感測元件與特定目標受器結合，使得兩個螢光基團遠離而失去 FRET 效應。（d）感測元件（substrate）被目標蛋白酶截切，使得兩個螢光基團遠離而失去 FRET 效應。
圖片來源：https://doi.org/10.3390/s21030795
本篇研究為了將多種不同的生物感測器標上特定的條碼，團隊挑選了四種不同的螢光蛋白，同時錯開了常用於生物感測器的螢光蛋白波段（450 ~ 550 nm），利用螢光蛋白在不同細胞結構上的組合來編碼。本研究使用四種螢光蛋白（TagRFP、mCardinal、iRFP702、EBFP2），搭配細胞中的四種不同的位置作為條碼的編碼。以圖三為例，條碼為 1200 即代表該細胞具有兩種螢光基團，第一種螢光基團 TagRFP 出現在細胞核的位置，第二種螢光基團 mCardinal 出現在細胞膜的位置。從四種不同的螢光基團挑選出兩種螢光基團自由出現在四種位置（其中位置不重複），組合共有 72 種（(4!/2!2!) x 4 x 3）。這些條碼各自對應到不同的生物感測器，因此在影像上可以同時拍攝不同條碼的細胞與其對應的生物感測器，透過測量其訊號，可以得知細胞中目標分子活性或數量的動態變化。
圖三、（A）條碼用的螢光蛋白（BFP、TRFP、mCar、iRFP ）與生物感測器用的螢光蛋白（CFP、GFP、YFP）的激發與放射波段。黑線為激發雷射光（條碼：405/561/633 nm；生物感測器：458 nm），藍色框線為放射光偵測範圍。（B）螢光蛋白條碼標記位置。（C）不同條碼用的螢光蛋白標記於不同位置（1：細胞核；2：細胞膜；3：核膜；4：細胞質）組成獨特條碼，分別對應至不同的生物感測器。（D）透過不同條碼可以在混合細胞群當中得知所對應的生物感測器。（E）生物感測器偵測結果與時間之關聯圖。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.11.005
除此之外，考量到人工判讀條碼效率有限，他們使用深度學習中的卷積神經網路（convolutional neural network）來自動判讀影像中每個細胞的條碼，其精準度可以達到 97%，但團隊發現深度學習模型用於解構紅色螢光基團的重疊光譜時效果欠佳，因此便重新改良了條碼的編碼策略（圖四）。相較於人工判讀 300 個細胞條碼所需約兩個小時，以深度學習模型判讀影像的時間能縮短至 10 秒鐘，並且在不同的細胞株的影像判讀上，也有平均高達 95% 以上的精準度。此外，改良後的流程可以放入更多的紅色螢光基團進行實驗，使得條碼的組合可以高達 100 多種。
圖四、改良後的螢光條碼編碼策略，使用紅色螢光蛋白（mCh/mCar/iRFP 其中之一）與藍色的 BFP。其中紅色螢光蛋白用於標記細胞中四個位置之一，而 BFP 則被標記於細胞核或細胞膜。先以深度學習模型分類 BFP 的影像，再以影像分析分離紅色螢光蛋白的重疊光譜。接著結合 BFP 影像和已分離的紅色螢光蛋白影像，並以深度學習模型再次分類。最後，經過閾值選擇與條碼存在驗證後才確定條碼。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.11.005
接著，他們針對常見於癌細胞中的致癌基因 KRAS ，以此技術進一步探究細胞的訊息傳遞。透過條碼編碼系統，帶有正常 KRAS （以下稱正常細胞）以及帶有 KRAS (G12V) 突變的細胞（以下稱突變細胞）可以在影像中準確地區別，並以此觀察細胞內的訊息變化（圖五 A），依照各訊息變化的先後次序，可以由數學模型推算得知各訊息分子的上下游關係（圖五 E）。在給予 EGF 刺激後，正常細胞和突變細胞的細胞訊號有相當不同的反應。為了解細胞間的溝通與互動，他們將兩種細胞混在一起培養。有趣的是，相較於分別培養的細胞，在混合培養的系統中，正常細胞內的各個訊息分子訊號似乎受到突變細胞的影響（圖五 B）。換句話說，就是好鄰居受到了惡鄰居的影響。
那麼這些細胞是如何溝通與影響彼此的呢？團隊猜想該訊號需要 MMP 或 ADAM 家族的金屬蛋白酶（metalloproteinase），因此在給予細胞刺激前，先加入基質金屬蛋白酶抑制劑（matrix metalloproteinase inhibitor, MMPi）。加入抑制劑後， 正常細胞與突變細胞在混合培養的環境中，細胞訊號的反應和單獨培養類似。回到先前的比喻，意味著此抑制劑能阻擋惡鄰居對好鄰居的影響。
最後，他們測量不同的抑制劑會如何改變訊號網路中傳訊分子的活性（圖五 F）。某些傳訊分子的活性可能被抑制；相反地，某些傳訊分子在細胞訊號網路中透過層層調控，反而活性增加。如此一來，便可以清楚了解，一種針對特定傳訊分子的抑制劑，是如何連帶調控到其他傳訊分子的活性，也能更準確地了解抑制劑可能的副作用機制，並控制藥物的使用。
總而言之，本研究以不同的螢光蛋白設計了一套條碼系統，並透過深度學習來快速判讀條碼，以提高實驗的通量。此研究透過精巧的實驗設計與安排，解構細胞間的溝通網路，並了解特定分子抑制劑對於細胞調控的影響，對於未來癌症研究與藥物設計上將扮演不可或缺的角色。
圖五、細胞中傳導訊號路徑與作用關係。(A) 正常細胞與 KRAS (G12V) 細胞 EGF 刺激後，生物感測器的訊號變化。(B) 分別培養與混合培養下，以 EGF 刺激時，KRAS 正常細胞與突變細胞中生物感測器的訊號變化。（E）生物感測器（藍色）與抑制劑 （紫色）對應於 RTK 訊息網路的節點。（F）抑制劑對於不同生物感測器的響應關係。黑色框線代表抑制劑所相應的抑制目標。（G）由抑制矩陣所求得之反饋迴路（feedback loops）。綠線代表正回饋關係，紅線代表負回饋關係。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.11.005
Main Article:
Yang, J., Chi, W., Liang, J., Takayanagi, S., Iglesias, P. A., & Huang, C. (2021). Deciphering cell signaling networks with massively multiplexed biosensor barcoding. Cell, 184(25), 6193-6206.e14. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.11.005
參考文獻：
[1] Greenwald, E. C., Mehta, S., & Zhang, J. (2018). Genetically encoded fluorescent biosensors illuminate the spatiotemporal regulation of signaling networks. Chemical reviews, 118(24), 11707-11794.
[2] Kim, H., Ju, J., Lee, H. N., Chun, H., & Seong, J. (2021). Genetically encoded biosensors based on fluorescent proteins. Sensors, 21(3), 795.
撰文｜楊淯元
審稿｜紀威佑
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