在 James Watson 和 Francis Crick 揭開 DNA 雙股螺旋結構後，基因工程技術發展日新月異，更加速了疫苗的研發。Maurice Hilleman 團隊首次利用基因工程，將酵母菌合成的重組 B 型肝炎病毒表面抗原蛋白（HBsAg）送入人體中。爾後科學家們也嘗試將 DNA 和 RNA 等遺傳物質送入動物體內製成疫苗 [1]。
雖然將外源 mRNA 送入體內，並利用體內細胞幫忙合成蛋白的概念相當簡單，也有科學家成功將外源 mRNA 注入小鼠肌肉中，且成功轉譯出蛋白質 [2]，但實際在研發的過程中卻困難重重，其中一大難題便是 RNA 會刺激類鐸受體 (Toll-like receptors, TLRs) 並引發強烈的先天性免疫反應，其中 TLR3 會辨識雙股 RNA 和 TLR7/8 會辨識單股 RNA。此外，短片段的雙股 RNA 也會被 RIG-1 受體辨識，引起第一型干擾素發炎反應與細胞凋亡，甚至使個體因此死亡 [3]，這一度澆熄科學家們對 mRNA 疫苗的熱情。不過經過匈牙利科學家 Katalin Karikó 博士與 Drew Weissman 教授合作，對此難題長達 30 年不遺餘力地研究，並於 2005 年發表一個新發現：以核苷修飾過的 mRNA （nucleoside-modifed mRNA）可以抑制其帶來的先天性免疫反應。在這篇發表中，其研究團隊以細胞株實驗分析帶有何種特徵的RNA較不會引起不良的先天性免疫反應。
首先，Katalin Karikó 博士 及 Drew Weissman 教授的團隊利用 lipofectin 將哺乳動物的細胞總 RNA、細胞核 RNA、細胞質 RNA、含 3 端 poly A 的 mRNA、 和 tRNA 轉染至單核球衍生的樹突細胞（monocyte-derived DCs, MDDCs）中，其中 tRNA 核苷被修飾的程度最高，且活化 MDDC 分泌發炎細胞激素 TNF-α 最少（圖一 a），說明核苷的修飾程度與免疫系統的活化有關。團隊更發現，經核苷修飾後的 RNA 不僅能降低發炎反應（圖一 b），且核苷上 m6A 和 s2U 修飾能抑制 RNA 刺激 TLR3 的能力，而 m6A、m5C、m5U、s2U 和 Ψ（pseudouridine） 修飾會阻斷 TLR7 和 TLR8 的刺激 [4]（圖一 c）。RNA 核苷修飾位點如圖一 d。
圖一、不同修飾的 RNA 轉染之 MDDC 產生免疫反應程度。
（a）外源 RNA 轉染至 MDDC 之 TNF-α 分泌量。（b）修飾和未修飾之 RNA 轉染至 MDDC 之 TNF-α 與 IL-21分泌量。（c）不同修飾的 RNA 抑制不同 TLR 刺激。（d）RNA 核苷修飾位點。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/mt.2008.200
在進一步的動物實驗中，透過脂質體將螢光酵素的編碼 mRNA 透過尾靜脈注射至小鼠體內，團對發現在小鼠脾臟中含有 ψ 修飾的 mRNA 轉譯效率比其他未修飾的 mRNA 高 （註一）。且螢光酵素的穩定性更高、表達時間更長，在注射 24 小時後，僅有含有 ψ 修飾的 mRNA 組別仍檢測到螢光酵素活性（圖二ａ）。並且比起含有 ψ 修飾的 mRNA ，未修飾的mRNA 在小鼠中引起更高的免疫反應（圖二b） [5]。
圖二、經 ψ 修飾之螢光酵素編碼 mRNA在小鼠中的表現活性。
（a）注射後 1、4 和 24 小時，小鼠脾臟之螢光酵素酶酵素編碼 RNA 表現量分析。（b）注射後6 小時小鼠血清樣本之 ELISA 分析。
圖片來源：https://doi.org/10.1038/mt.2008.200
這一重大發現成為 COVID-19 疫情中疫苗研發的重要功臣，其中已上市的 COVID-19 疫苗 BNT162b 即是利用相似於 ψ 修飾的 N1-methylpseudouridine 取代尿苷，以抑制 TLR7/8 辨識相鄰的尿嘧啶重複序列而活化，使得疫苗能在短時間內被設計出來，並提供有效的保護力，且較不易產生嚴重的免疫反應。除此之外，這一研究成果也重新點燃了科學家們對 mRNA 探究的熱情，引領世界走向 RNA 世代。
註1： 假尿苷（Pseudouridine, Ψ）是一種尿苷（uridine）的同分異構物，其中尿嘧啶鹼基和核糖之間的 N1-C1′ 鍵斷裂，並重新形成 C5-C1′ 糖苷鍵。由於異構化產生的 CC 鍵，使鹼基可以自由旋轉，並比尿苷多出了一個可形成氫鍵的位點，使通過改善鹼基配對和鹼基堆疊，故此由假尿苷取代尿苷後的 RNA 其骨架能產生更多剛性，並讓結構更穩定 [6]。
延伸閱讀｜2022 唐獎生技醫藥獎──mRNA 疫苗發展的學理基礎
參考文獻：
1. Stanley, P., & Plotkin, S. A. (2014). History of vaccination. Proceedings of the National Academy of Sciences, 111(34), 12283-12287. https://doi.org/10.1073/pnas.1400472111
2. Wolff, J. A., Malone, R. W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A., & Felgner, P. L. (1990). Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science, 247(4949), 1465-1468. http://doi.org/10.1126/science.1690918
3. Stuart, L. M. (2021). In gratitude for mRNA vaccines. New England Journal of Medicine, 385(15), 1436-1438. DOI: 10.1056/NEJMcibr2111445
4. Karikó, K., Buckstein, M., Ni, H., & Weissman, D. (2005). Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity, 23(2), 165-175. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2005.06.008
5. Karikó, K., Muramatsu, H., Welsh, F. A., Ludwig, J., Kato, H., Akira, S., & Weissman, D. (2008). Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy, 16(11), 1833-1840. https://doi.org/10.1038/mt.2008.200
6. Morais, P., Adachi, H., & Yu, Y. T. (2021). The critical contribution of pseudouridine to mRNA COVID-19 vaccines. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 9. https://doi.org/10.3389/fcell.2021.789427
撰文｜吳佳勳
審稿｜蕭皓文
