近年來最火紅的生技醫藥技術莫過於在新型冠狀病毒（SARS-COV-2）疫情肆虐下，在全世界拯救無數人命的 mRNA 疫苗。而除了疫苗外，RNA 大家族這幾年也有許多相關新藥陸續問世或投入臨床試驗 [1]，從反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASO）、小片段干擾 RNA（small interfering RNA）、核酸適體（aptamers）等，到 CRISPR-Cas9 基因編輯使用的 gRNA，都是 RNA 的相關技術。然而想將 RNA 做成藥物並不容易，其中最主要的挑戰在於這些外來的 RNA 可能被免疫系統所辨認，進而引發免疫反應及各種副作用。而為了克服這些難題，科學家們也陸續開發了對應的解決方法[2][3]，其中 2022 年唐獎生技醫藥獎三位得主中的 Katalin Karikó 博士以及 Drew Weissman 博士獲獎的主要的貢獻便是發現經過核苷修飾的 RNA 可去除免疫原性，克服了 mRNA 疫苗及各式 RNA 藥物應用上的一大挑戰[4]。
不幸的是，RNA 的化學修飾能雖然能明顯減少免疫機制的活化，卻無法完全避免，仍有少量 RNA 會被免疫系統的樣式辨識受體（pattern recognition receptor）所辨識，而這可能是來自合成過程中產生的不純物如小片段的雙股 RNA 等。因此本篇延續前篇介紹 Dr. Katalin Karikó 及 Dr. Drew Weissman 的研究，其進一步利用高效液相層 （high-performance liqid chromatography，HPLC）去除這些不純物，並且與化學修飾並用時，幾乎可以完全消除不良的免疫反應。
研究中首先使用人工合成的小鼠紅血球生成素 mRNA 進行墨點印跡試驗（dot blot assay），發現人工合成的 mRNA 可能帶有雙股RNA的不純物（圖一A）。將編碼螢光蛋白與小鼠紅血球生成素的四種 mRNA 各自送入樹突細胞（dendritic cell，DC）後，觀察到未經修飾的四種 mRNA 樣本都會引起發炎介質 TNF-α 及 IFN-α 的生成，雖然經過假尿苷（pseudouridine）或 5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine）及假尿苷雙重修飾後，TNF-α 生成量確實明顯減少，但仍有 IFN-α 生成（圖一B、C）。
圖一、（A）未經純化的 mRNA 帶有雙股 RNA 不純物（B、C）經過核苷修飾的 mRNA 若未經過純化，雖可減少 TNF-α，但仍會刺激 IFN-α 的生成
圖片來源：https://doi.org/10.1093/nar/gkr695
為了去除可能的雙股 RNA 雜質，研究團隊發現在 HPLC 純化 mRNA 的過程中使用烷基化、非孔洞性的聚苯乙烯-二乙烯苯管柱與乙酸三乙銨/乙腈梯度沖提的組合時，可有效分離雜質與 mRNA 產物（圖二A），並且送入樹突細胞後產生的 TNF-α IFN-α 也明顯減少（圖二B、C）。進一步分析純化前後之 mRNA 處理的樹突細胞內基因表現量變化發現發炎相關基因的表現量皆明顯降低。最後，研究團隊也證實經由核苷修飾及 HPLC 處理的 mRNA 可提供明顯較高的蛋白產量，也不會對細胞產生毒性。
圖二、（A）經過 HPLC 純化的 mRNA 可去除雙股 RNA 不純物（B、C）經過 HPLC 純化的 mRNA 可降低 TNF-α 及 IFN-α 的表現量
圖片來源：https://doi.org/10.1093/nar/gkr695
核修飾及 HPLC 純化 mRNA 的技術在後續也被許多研究採用，其中莫德納公司的研究團隊更是進一步探討了兩種方法涉及的免疫辨識途徑及影響 [5]，團隊研究發現雙股 RNA 主要是由 RIG-I 及 TLR-3 受體所辨認並可透過 HPLC 純化避免，而未修飾的單股 RNA 則是由 TLR-7/8 受體所辨識並可由核苷修飾克服（圖三）。這些研究成果不但奠定了外源性 RNA 對免疫系統影響的研究基礎，讓更多科學家投入 RNA 的研究當中，也直接促成了 mRNA 疫苗的誕生，並為對抗新冠病毒做出了巨大的貢獻。
圖三、外源 mRNA 的免疫辨識途徑
圖來源：https://doi.org/10.1126/sciadv.aaz6893
Main Article:
Karikó, K., Muramatsu, H., Ludwig, J., & Weissman, D. (2011). Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA. Nucleic acids research, 39(21), e142. https://doi.org/10.1093/nar/gkr695
參考文獻：
1. RNA藥物對抗疾病！2021持續閃耀！
2. Broering, R., Real, C. I., John, M. J., Jahn-Hofmann, K., Ickenstein, L. M., Kleinehr, K., Paul, A., Gibbert, K., Dittmer, U., Gerken, G., & Schlaak, J. F. (2014). Chemical modifications on siRNAs avoid Toll-like-receptor-mediated activation of the hepatic immune system in vivo and in vitro. International immunology, 26(1), 35–46. https://doi.org/10.1093/intimm/dxt040
3. Wienert, B., Shin, J., Zelin, E., Pestal, K., & Corn, J. E. (2018). In vitro-transcribed guide RNAs trigger an innate immune response via the RIG-I pathway. PLoS biology, 16(7), e2005840. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2005840
4. Karikó, K., Buckstein, M., Ni, H., & Weissman, D. (2005). Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity, 23(2), 165–175. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2005.06.008
5. Nelson, J., Sorensen, E. W., Mintri, S., Rabideau, A. E., Zheng, W., Besin, G., Khatwani, N., Su, S. V., Miracco, E. J., Issa, W. J., Hoge, S., Stanton, M. G., & Joyal, J. L. (2020). Impact of mRNA chemistry and manufacturing process on innate immune activation. Science advances, 6(26), eaaz6893. https://doi.org/10.1126/sciadv.aaz6893
撰文｜葉國掄
審稿｜蕭皓文
[…] [5] 2022年第五屆唐獎系列報導 – HPLC 純化的 mRNA 可降低免疫原性 […]