在 2021 年 9 月，The Invesitgator Taiwan 以細胞衰老與老化為主題介紹了一系列的相關論文，我們以老化機制與疾病的關聯以及如何將老化當作治療契機的研究為主軸進行報導。細胞衰老與老化其實是一個細胞慢性變老的過程，在這個過程中，細胞的生理功能會逐漸喪失，此時生物體承受的疾病風險也隨之增高，因此探討細胞老化的機制也成為科學家研究重點之一 [1]。
延伸閱讀｜2021 年 9 月細胞衰老與老化主題月
科學家歸納了數種細胞老化的特徵，其中包括了基因體不穩定性 (genome instability) 及表觀遺傳變異 (epigenetic alterations) [1]。在酵母菌的研究中，科學家指出組蛋白 (histone) 的表現量及組蛋白上的表觀遺傳調控皆與細胞老化及壽命 (longevity) 相關，這項發現暗示了隨著時間流逝，表觀遺傳會隨之改變 [2]。此外，因 DNA 損傷 (DNA damage) 抑或是組蛋白喪失導致的基因體不穩定也會促進細胞老化 [2]。然而，表觀遺傳如何隨著時間流逝改變，而這項改變是如何調控老化則仍有待探討。由哈佛大學 David A. Sinclair 教授領軍的研究團隊透過小鼠的實驗模型對這道重要的生物問題進行系統性的探討。
由於在酵母菌中，DNA 雙股斷裂 (DNA double-strand breaks, DSBs) 為促使表觀遺傳變化最常見的推手之一 [3] ，因此研究團隊首先建立了一套以 tamoxifen (TAM) 誘導、可以在老鼠體內及細胞內產生 DSBs 的系統。團隊利用 LoxP-Cre 表現 I-PpoI 核酸內切酶 (endonuclease)，其辨認並進行切割的 DNA 序列多數都不在基因的轉錄位置，也不在粒線體的 DNA 上，以確保不會造成改變基因功能的突變，而這個系統被團隊命名為 ICE 小鼠 (the Inducible Changes to the Epigenome system) (圖一A)。
圖一：表觀遺傳老化與老鼠細胞內 DNA 雙股斷裂累積有關。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.12.027
接著團隊分離出 ICE 小鼠的胚胎纖維母細胞 (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) 後，加入 TAM 並量化 DSBs 及評估表觀遺傳老化 (epigenetic age) 的特徵。結果顯示，相較於控制組小鼠 (Cre)，ICE 小鼠細胞在被加入 TAM 後呈現較多的 γ-H2AX (DSBs 的生物標記) (圖一B-C)。此外，團隊透過簡化代表性的亞硫酸鹽定序技術 (reduced representation bisulfite sequencing, RRBS) 偵測單一核苷酸上的甲基化 (methylation)，並計算與老化相關的甲基化位點數量，進而評估表觀遺傳的「老化程度」，數量越多，表示表觀老化程度越高 (圖一 E)。結果顯示 ICE 小鼠細胞有 89 個與老化相關的甲基化位點，明顯高於控制組小鼠 (圖一 E)。此外，團隊也透過量化老化細胞內過度表現的基因，例如：SA-β-gal、IL-6、CCL2 等，驗證 ICE 小鼠確實出現了老化特徵 (圖一 F-H)。團隊也在後續實驗證實，以 I-PpoI 為基礎的小鼠模型沒有出現突變的特徵。
上述實驗中，團隊對於 ICE 小鼠細胞進行分子層面的探討，接著團隊對個體層級的老化程度進行研究。團隊對五個月大的 ICE 小鼠進行 TAM 處理，TAM 處理後一個月及十個月時，針對小鼠外型、體重、呼吸交換速率 (respiration exchange rate, RER), 骨質質量 (mass) 及密度 (density)、行為等進行觀察與測量，經 TAM 處理後一個月的 ICE 小鼠與控制組小鼠並無太大差異，但經 TAM 處理後十個月的 ICE 小鼠顯示的外型特徵皆老於同年紀的控制組小鼠，所有線索直指 ，相較於控制組小鼠，ICE 小鼠在經過時間流逝後，更快出現了老化特徵 (圖二)。因此在後續的老化評估實驗中，團隊會以經 TAM 處理後十個月的小鼠為實驗模型。
圖二：ICE 小鼠與控制組小鼠的外型差異。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.12.027
團隊接下來進一步研究器官層級的老化特徵。以腦部為例，哺乳動物細胞的老化會使中樞神經系統的功能降低，例如活動、記憶及認知的能力 [4]。研究結果指出：相較於控制組小鼠，ICE 小鼠呈現了數種腦部老化的特徵，例如：在暗室時移動速度較為緩慢、步態受損；透過情境恐懼制約 (contextual fear conditioning) 實驗觀察到 ICE 小鼠短期記憶力較差、利用巴恩斯迷宮 (Barnes maze test) 發現 ICE 小鼠長期記憶力較為薄弱，顯示 ICE 小鼠腦部出現老化情形。
團隊同時也對肌肉組織進行分析，肌肉細胞老化的特徵為：ATP 及粒線體 DNA下降、肌肉纖維的型態改變等 [5]。團隊的結果指出，相較於相同年紀的控制組小鼠，ICE 小鼠的肌肉量較低，肌肉持久力 (endurance) 也較低，同時也出現運動過後的乳酸堆積量較高等肌肉老化特徵。
上述的實驗結果顯示 ICE 小鼠有明顯的老化特徵，而團隊接下來利用質譜分析量化 46 種組蛋白修飾，發現 ICE 小鼠細胞中的 H3K27ac 與 H3K56ac 較控制組小鼠低，而 H3K122ac 則較高。團隊接著針對 mRNA 表現與染色質進行定序分析，發現在 ICE 小鼠中，關於細胞身份 (cell identity) 及發育過程的基因表現 (例如：Hox 家族) 下降許多，而這歸因於不正常 H3K27ac 導致的染色質結構異常。值得注意的是，在 ICE 小鼠細胞內 H3K27me3 較低的基因區域多數與神經發育相關，因此團隊透過化學藥物實驗證實經過 ICE 系統處理過的老鼠細胞會較容易偏移自己的細胞身份，並分化成其他細胞型態。綜述上述結果，這是目前第一個實驗證據證實 DNA 損傷與修復可以改變表觀遺傳標記並促進老化。
因此團隊推測若能「重設」表觀遺傳的標記 (reset the epigenome)，也許就能扭轉老化的特徵，為了證實這個猜測，團隊在 ICE 小鼠細胞中表現三個山中因子 (Yamanaka factors)，分別為 Oct4、Sox2、及 Klf4 (簡稱 OSK) [6]。結果顯示，OSK 的表現扭轉了 ICE 小鼠細胞的 mRNA 表現、表觀遺傳的老化程度與腎臟及肌肉的老化生物標記 (biomarker) 也回復至與控制組相似。老化過程時，哺乳類的水晶體會出現混濁狀況 (lens opacity)，視網膜神經節細胞 (retina ganglion cells, RGCs) 數量也會下降，這兩個特徵也在 ICE 小鼠身上出現；然而經過 OSK 表現後，水晶體混濁及視網膜細胞數量下降的情況大幅改善，甚至無異於年輕小鼠，證實調控表觀遺傳的標記可以扭轉老化現象。
這篇研究指出隨著時間流逝，DSBs 的累積會導致不正常的表觀遺傳標記，團隊認為這是由於修飾染色質的相關因子的位置發生改變 (relocalization of chromatin modifier, RCM)，進而推動老化的發生 (圖三)，團隊也證實若能透過表觀遺傳重組 (epigenetic reprogramming)，可以使原本老化的老鼠出現年輕的表徵。老化向來被認為是不可逆的過程，但這篇研究的立場正好與這個論述相反。雖然人類的生理系統較實驗小鼠來的複雜許多，但透過持續不斷的研究，相信能為老化相關疾病提供更好的治療策略。
圖三：控制組與老化的小鼠細胞的表觀遺傳標記、染色質結構皆不同，透過表觀遺傳的重組 (epigenetic reprogramming)，可以扭轉小鼠的老化現象。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.12.027
Main Article: Yang, J. H., Hayano, M., Griffin, P. T., Amorim, J. A., Bonkowski, M. S., Apostolides, J. K., … & Sinclair, D. A. (2023). Loss of epigenetic information as a cause of mammalian aging. Cell. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.12.027
參考文獻：
1. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., & Kroemer, G. (2013). The hallmarks of aging. Cell, 153(6), 1194-1217. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.05.039
2. Sen, P., Shah, P. P., Nativio, R., & Berger, S. L. (2016). Epigenetic mechanisms of longevity and aging. Cell, 166(4), 822-839. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.07.050
3. Park, P. U., Defossez, P. A., & Guarente, L. (1999). Effects of mutations in DNA repair genes on formation of ribosomal DNA circles and life span in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology, 19(5), 3848-3856. https://doi.org/10.1128/MCB.19.5.3848
4. Ungvari, Z., Tarantini, S., Hertelendy, P., Valcarcel-Ares, M. N., Fülöp, G. A., Logan, S., … & Yabluchanskiy, A. (2017). Cerebromicrovascular dysfunction predicts cognitive decline and gait abnormalities in a mouse model of whole brain irradiation-induced accelerated brain senescence. Geroscience, 39, 33-42. https://doi.org/10.1007/s11357-017-9964-z
5. Demontis, F., Piccirillo, R., Goldberg, A. L., & Perrimon, N. (2013). Mechanisms of skeletal muscle aging: insights from Drosophila and mammalian models. Disease models & mechanisms, 6(6), 1339-1352. https://doi.org/10.1242/dmm.012559
6. Simpson, D. J., Olova, N. N., & Chandra, T. (2021). Cellular reprogramming and epigenetic rejuvenation. Clinical Epigenetics, 13(1), 1-10. https://doi.org/10.1186/s13148-021-01158-7
撰文｜蕭皓文
審稿｜劉姿婷
