古人說的好，眼見為憑，seeing is believing。所以自古以來，「觀察」可說是科學研究的第一步。但是對於非肉眼直接可見的世界，到底什麼樣的程度叫「看見」？對生命科學來說，從 17 世紀英國科學家虎克（Robert Hooke） 在光學顯微鏡下觀察到軟木塞的小方格命名為「細胞」的英文「cell」和荷蘭科學家雷文霍克（Antony van Leeuwenhoek）堅持的打磨設計透鏡觀察到微生物的那天起，人類就為了能看見更清楚的生命而奮力不懈。生命科學中最「小心眼」的科學從生物化學、生物物理學到分子生物學，著重生命中最接近非生命的部分 – 核酸與蛋白質等等。科學家試圖以各式各樣的研究方法與工具，了解這些生物巨分子如何完成「生命」這件事。這篇文章將概述結構生物學，以及目前常用的研究工具的研究策略，並討論目前的研究趨勢。

結構生物學這個概念的發展可以源自於 20 世紀初期X光繞射（X-ray diffraction）現象的發現。科學家們以生物巨分子的結構，更具體的提出假設，設計實驗而驗證生物體中的各式生理現象。舉個例子來說，DNA 雙股螺旋結構的發現，讓科學家理解 DNA 半保留複製的模型（圖一）；又或者蛋白質 Prolyl isomerase Pin 1 過量表現促使腫瘤生長，而科學家發現綠茶多酚 EGCG (epigallocatechin-3-gallate) 能與 Pin1 專一性結合並抑制其促使腫瘤生長的能力，證實長久以來綠茶有助於抗癌的說法（圖二）。

結構生物學研究的工具

結構生物學研究的工具，常見的包括一級結構胺基酸序列的質譜儀與蛋白質定序；二級結構 alpha-螺旋 (alpha-helix)、beta-摺疊 (beta-sheet) 等結構的圓偏光二色光譜 (circular dichroism, CD)；蛋白質整體結構的三級結構與蛋白質生理狀態多聚體 (oligomer) 四級結構的核磁共振光譜儀 (nuclear magnetic resonance spectroscopy of proteins, protein NMR)、X 光晶體學 (X-ray crystallography)、冷凍電子顯微鏡 (cryo-electron microscopy, cryo-EM) 以及其他可提供分子層級結構資訊的原子力顯微鏡 (atomic force microscopy, ARF)、電子順磁共振光譜 (electro paramagnetic resonance spectrometer, EPR)、多角度雷射光散射儀 (multiangle light scattering, MALS)、小角度光散射（small angle light scattering, 包括 small angle x-ray scattering (SAXS)、small angle neutron scattering (SANS) 等）、雙偏極化干涉儀 (dual polarization interferometry, DPI) 等等。這些工具的原理屬於生物物理學，配合結構生物學想解決的問題各有不同的用法與適用範圍 (圖三)。目前「解析」結構的工具主要是 protein NMR、X-ray crystallography 與近年來技術漸趨成熟的 cryo-EM。

X-ray crystallography

自從19 世紀末、20 世紀初期，德國科學家侖琴（Wilhelm Conrad Röntgen）發現了 X-ray；1953 年 Nature 上華生 (James Dewey Watson) 與克里克（Francis Harry Compton Crick）發表了 DNA 雙股螺旋的結構（圖四），促使許多分子生物學的機制模型與假說得以經由實驗驗證。1958 與 1963 年由肯德魯（John Cowdery Kendrew）和佩魯茲（Max Ferdinand Perutz）先後發表肌紅素（myoglobin）和血紅素（hemoglobin）的結構，讓生化學家了解這些蛋白質如何利用 cofactor 與氧分子結合，在不同氧氣濃度的情況下，由於蛋白質結構的改變，進而影響蛋白質與氧分子的親和性。這些科學家的研究成果奠定了 X-ray crystallography 的基礎，並連結蛋白質結構與功能的研究。X-ray 是指波長 0.02-100 Å 的電磁波。由於其波長與原子大小相當，所以可以產生繞射，進而解析結構。但由於單一生物巨分子產生的繞射訊號太微弱，所以必須靠規則排列的晶體放大訊號，所以對於 X-ray crystallography 來說，得到合適的晶體是一個門檻。

蛋白質分子整齊排列而成的晶體，經由 X-ray 繞射後產生的繞射圖形與其他獲取數據時的系統參數，藉由傅立葉轉換（Fourier transform）等數學運算後，獲得蛋白質在晶體狀態下靜態結構的電子雲密度圖。蛋白質晶體內部含水量有 40-60%，所以雖然是晶體狀態下靜態的結構，其特性與生理狀態上仍十分接近。與其他結構生物學工具相比，X-ray crystallography 是目前獲得高解析度結構最有效的方式。

X-ray crystallography 對於樣本最大的要求就是要有適當的結晶。要能達成這個目標，蛋白質樣本的濃度至少由 10 mg/mL、均質且純度大於 95%（與 protein NMR 的需求類似）的樣本篩選結晶條件。以中央研究院蛋白結構分析核心設施的結晶篩選系統 Rigaku phoenix RE為例，理想狀態下可 10 uL 進行 96 種不同結晶條件的篩選。在能得到合適晶體之前，蛋白質都是在 mg 到 g 的需求量下進行（圖五）。

X-ray crystallography 近況

同步輻射 (synchrotron) 光源是利用電子在接近光速移動時，受到磁場作用產生偏轉時，會以切線方向發射極強的電磁波稱之。同步輻射光源的強度比傳統實驗室內的 X-ray 強約數百倍，可大幅提升生物大分子解析速度與解析度。在臺灣，第一座同步輻射加速器已經運作近 20 年，提供臺灣與全世界使用者穩定的光源。更預計於今年提供「臺灣光子源」- 將成為目前世界上最強的光源。而目前最新的光束線設置方法 ── 自由電子雷射 X-ray Free Electron Laser (XFEL) 可以說是次世代研究中最佳的光源設置 (圖六)。以日本理化學研究所 (理研，RIKEN) 例，他們的同步輻射加速器 SPring-8 產生的光源強度是陽光的百億倍；而他們的 XFEL 的光強度更是 Spring-8 X-ray 的十億倍。雖然 XFEL 能量很強，會對生物樣本分子造成的傷害，但目前在 femtosecond 下，這樣的光源有機會可以將以「結晶」繞射提升到「單分子」繞射的層次 ── 這表示未來極有可能不需要經過蛋白質結晶這個步驟，就可以得到原子級解析度的結構，突破以往蛋白質一定要在晶體狀態下才能進行繞射實驗的瓶頸。但是相對應的後續繞射數據處理，會再度成為新的門檻，需要更多具有電腦、物理與數學背景的人一起合作，才能真正開啟單分子繞射結構解析的大門。

NMR

1950 年代前後，美國物理學家拉比 (Isidor Isaac Rabi)、瑞士物理學家布洛赫 (Felix Bloch) 和美國物理學家珀塞爾 (Edward Purcell) 三人的研究發現，具有核自旋性的原子核，在強力磁場中，吸收適當能量之高頻電磁波後，和由低量子態激發到高量子態而稱為核磁共振。化學家利用分子結構影響氫原子的磁場變化 (chemical shift)，發展核磁共振光譜儀。從傳統的一維 ¹H、¹³C、¹⁵N 譜到二維光譜以及隨著能提供更高磁場的超導磁鐵的進展，到了 1990 年代，瑞士物理學家恩斯特 (Richard Robert Ernst) 與瑞士化學/生物物理學家余特里希（Kurt Wuethrich）兩位先驅開啟了 protein NMR 的大門。Protein NMR 相較於 X-ray crystallography 技術發展較晚，但由於不需要得到蛋白質晶體即可解析結構，所以對於分子量較小的蛋白質結構解析來說，一旦能準備合適的蛋白質樣本，protein NMR 可以說是最有利的工具（圖七）。

蛋白質三級結構提供了立體空間中每個氫、氮、碳原子獨特的化學環境，利用 protein NMR 測量這些原子們對應的化學位移 (chemical shift) 資訊。由於蛋白質在水溶液中，所以可以解析蛋白質動態的結構資訊。同時，有些蛋白質的部分結構，得在細胞中與其他生物分子作用後才能形成穩定結構，一般狀態下則沒有固定構型；這些區塊通常在 X-ray crystallography 中無法被解析，或者需要去除這些部分才能形成結晶。

在 protein NMR 中透過光譜計算得到的限制條件 (constrains)，以最低能量與合理結構歸納出原子間的相對關係 (distance restraints)，因此 protein NMR 同時能解析多種結構。在 protein NMR 的結構中，限制條件是重要的結構品質參數。protein NMR 的結構不能討論解析度，不過根據限制條件中最終結構主鏈骨架的 RMSD (root mean square deviation) 為例，小於 0.3 可視為 2.5Å 的結構。另外，因為 protein NMR 可以得到氫原子的位置，與 X-ray crystallography 得到的電子雲密度相比，雖然主鏈上的資訊相同，但是如果要討論與氫原子有關的機制，protein NMR 可以提供更多的資訊。

目前普遍 protein NMR 可以解析的蛋白質分子量範圍需要小於 25 kD，一般需要 1 mM 的蛋白質，以 15 kDa 的蛋白質為例，大約需要 10 mg 的蛋白質、純度需要在 95% 以上。蛋白質樣本的溶劑應盡量接近純水，避免含有 C-H 鍵結的添加劑。蛋白質樣本在常溫下維持穩定數周，不能產生任何沉澱以及降解。如欲解析更高分子量的蛋白質結構，為了降低光譜訊號複雜度與減少光譜的重疊，利用需要 ¹⁵N 或是 ¹³C 標定蛋白質，甚至是 ²H 可以有效的增加靈敏度與解析度。

NMR 近況

目前在臺灣，protein NMR 是以校為單位能夠擁有維護的儀器。根據貴重儀器中心的資料，全臺灣北中南學校共有七台儀器，另外在中央研究院也有多台儀器開放各單位申請使用。雖然 protein NMR 在大分子量蛋白質結構解析上有許多限制，但是配合局部胺基酸標記 (amino acid specific labelling) 的技術，可以將複雜的光譜訊號分離，解決光譜解析度的問題。同時，更高磁場的 NMR 儀器也可以提高解析度，目前廠商 Bruker 已發展出 1 GHz (23.5 Tesla) 的 NMR 儀器。另外，儀器靈敏度與探頭 (probe) 有關，經過特殊設計的低溫探頭 (cryoprobe or cold probe) 可以降低熱雜訊，使訊號提高 3-4 倍。除了儀器的進展讓 protein NMR 可以解析更廣範圍的蛋白質結構外，成熟的 protein NMR 技術也已經被用於高通量蛋白質小分子交互作用篩選，作為新藥開發以及藥物篩選的平台。近年來，科學家更嘗試利用在細胞中的蛋白質，直接以 protein NMR 進行結構分析；讓蛋白質結構更接近正在工作的生理狀態。

Cryo-EM

Cryo-EM 是穿透式電子顯微鏡 (transmission electron microscopy, TEM) 的一種。最大的特色就是樣本被快速冷凍而不經過染色與固定，以生物巨分子的蛋白質與核酸等樣本來看，更接近原本的生理條件。Cryo-EM 的結構是來自樣本不同角度 2D 影像重組出的 3D 結構。目前 cryo-EM 結構的解析度尚未達到原子等級，但配合演算法等工具可以利用部分已知晶體結構資訊代入，得到蛋白質功能性區塊等介於二級結構到三級結構間變化的訊息。傳統電子顯微鏡技術對於生物樣本除了高能電子束的輻射傷害以外，還有為了避免電子被氣體分子干擾，樣本需在真空狀態下進行測量，使得樣本呈現脫水 (dehydration) 的狀態。直到 1975 年，科學家成功的將樣本冷凍在一薄層的無序冰中 (amorphous or vitreous solid water)，奠定了 cryo-EM 的基礎。

Cryo-EM 與 X-ray crystallography 和 protein NMR 最大的不同是，得到的影像數據是生物樣本 3D 結構的 2D 投影。由於生物樣本對於輻射傷害相當敏感，取得影像數據的同時生物樣本也受到了傷害。這些影像通常有相當高的背景值，所以必須透過大量 2D 投影影像數據平均後重組，才能得到 3D 結構，這個過程稱為單分子分析三維影像重組 (single particle analysis & 3D model reconstruction)，重組後的 3D 結構是電子雲密度圖。目前 cryo-EM 的結構解析度約在 7-9Å，根據這個解析度的電子雲密度可以粗略判斷 alpha-helix 的結構，而其他二級結構以及胺基酸的側鏈結構是無法推測的。但是對於多聚體蛋白質來說，其資訊足以解析四級結構相對位置以及多聚體的組裝 (assembly) 訊息。

相較於 protein NMR 與 X-ray crystallography，cryo-EM 需要的樣本總量與濃度都低了 10-100 倍左右。但是對於純度的要求也相對提高，一般來說，純度需要 99% 以上。此外，大分子的成像效果較好，目前仍希望樣本大小要大於 300 kDa。

Cryo-EM 近況

在臺灣，中央研究院與數間國立大學擁有 cryo-EM 與相關設備，雖然依儀器的價格來看屬於貴重儀器，但是目前仍是以實驗室為單位運作。其中最關鍵的原因是相較於 protein NMR 與 X-ray crystallography 成熟的實驗流程，cryo-EM 無論是儀器或是研究方法仍有許多需要微調的參數，依臺灣目前的現況難以以核心設施或貴重儀器設費的方式提供服務。2014 年，科學家開發出可以直接偵測電子的新型 cryo-EM 偵測器，大幅提高影像解析度，並解出數個約 3.5Å 解析度的結構，這是 cryo-EM 非常大的進展，確立了結構生物學三大工具都進入了近原子解析度的領域。同時，也解出了一個分子量僅 170 kDa 的酵素複合體結構，解析度達 4.5Å，改寫了 cryo-EM 適用分子量範圍。突破了解析度與分子量限制的 cryo-EM，配合 protein NMR 與 X-ray crystallography，將能提供結構生物學研究更完整的視野。

結構生物學的未來

根據 RCSB PDB (https://www.rcsb.org/) 網站的資訊，截至 2015 年 2 月，總共有 106710 個生物巨分子結構的資訊，35257 個結構來自獨特的蛋白質序列。其中，89% 的結構資訊來自 X-ray crystallography、10% 來自 protein NMR、1% 來自 electron microscopy。目前結構解析的速度大約達到飽和，自 2010 年起每年約有接近 9000 個新結構。但是自 2012 年後已經沒有新的 folding 被發現，這反應了一個很關鍵的原因 ── 無論使用哪一種技術進行蛋白質結構解析，都需要先拿到蛋白質，然而自從基因體學以及合成生物學成熟快速的發展，得到特定蛋白質的 DNA 序列已經非常容易，因此，配合適當的蛋白質生產宿主、大量表達、純化方式以及得到合適解析結構的狀態，將成為下一個階段的課題。

結構生物學實屬於分子生物學、生物化學與生物物理學的分支，著墨生物巨分子的原子級解析度的結構、在細胞中行使功能時結構的變化，或是和其他細胞內分子作用的情形等等。這百年來，仰賴科學家們奮力不懈，各式研究方法越來越成熟，越來越多步驟得以「自動化」進行。一旦鎖定目標蛋白質後，對於得到結構漸漸有跡可循。真正得到結構以後，如何「看圖說故事」，才能發揮結構生物學最大的目的與價值。例如，1990 年Roberts 等人根據人類 HIV proteinase 結構，設計出一系列短鏈胜肽衍生物，模擬人類 HIV proteinase 催化水解反應時基質的中間態；其中最好的藥物對 HIV-1 與 HIV-2 proteinase 抑制濃度為 nanomole，而對人類類似功能的蛋白質抑制濃度差距接近千倍。⁶這樣的高專一性可以大大降低藥物對人體的副作用。這類以結構為基礎的藥物設計，研究的方法與平台仍在推陳出新，成為目前結構生物學中重要的一個分支。同樣利用結構的資訊，進行蛋白質功能與特性優化改良的蛋白質工程學 (protein engineering) 也是一個受到結構生物學影響的主題。今年，Regina 等人的研究團隊利用結構資訊，分析蛋白質藥物製劑中可能造成免疫反應的部分，改造後的七個 P99 beta-lactamase 藥物候選人最高可減少 47% 的可能造成免疫反應的結構 (epitope)。⁷近年來蛋白質藥物製劑的重要性提高，減少這些要蛋白質藥物容易引起免疫反應的部分，對於用藥安全有相當大的幫助。

總而言之，解出結構不是一個目標蛋白質研究的結束，而是一個嶄新的開始。成為其他技術研究基石的結構生物學，將漸漸從分支成為新的研究起點。

相關閱讀

• 核磁共振光譜在結構生物學的應用 (http://bc.imb.sinica.edu.tw/images/biotech/08_10.pdf)
• X-光晶體繞射學與結構生物學 (http://bc.imb.sinica.edu.tw/images/biotech/07_09.pdf)
• Protein NMR – A Practical Guide (http://www.protein-nmr.org.uk/)
• A Brief Introduction to Protein Crystallography by Dave Lawson (https://www.jic.ac.uk/staff/david-lawson/xtallog/summary.htm)
• 50 Years of Protein Structure Determination Timeline – HTML Version – National Institute of General Medical Sciences (https://publications.nigms.nih.gov/psi/timeline_text.html)
• Estimating Protein-Ligand Binding Affinity using High Throughput Screening by NMR. (2008) J Comb Chem. 10: 948. doi:10.1021/cc800122m.
• Protein structure determination in living cells by in-cell NMR spectroscopy. (2009) Nature. 458: 102. doi:10.1038/nature07814
• The Process of Structure-Based Drug Design (2003) Chemistry & Biology. 10: 787 doi:10.1016/j.chembiol.2003.09.002
• The Resolution Revolution. (2014) Science. 343: 1443. doi:10.1126/science.1251652
• How cryo-EM is revolutionizing structural biology. (2015) Trends in Biochemical Sciences. 40: 49. doi:10.1016/j.tibs.2014.10.005

參考文獻

1. Epigallocatechin-gallate suppresses tumorigenesis by directly targeting Pin1. (2011) Cancer Prev Res (Phila). 4: 1366. doi: 10.1158/1940-6207.
2. Molecular Configuration in Sodium Thymonucleate. (1953) Nature. 171: 740. doi:10.1038/171740a0
3. Automation of X-ray crystallography. (2000) Nature Structural Biology. 7: 973. doi:10.1038/80754
4. Macromolecular NMR spectroscopy for the non-spectroscopist. (2011) FEBS Journal. 278: 687. doi: 10.1111/j.1742-4658.2011.08004.x
5. Protein structure determination in living cells by in-cell NMR spectroscopy. (2009) Nature. 458: 102. doi:10.1038/nature07814
6. Rational design of peptide-based HIV proteinase inhibitors. (1990) Science. 248: 358. doi:10.1126/science.2183354
7. Biotechnology and Bioengineering. (2015) in press

作者簡介
傅煦媛 Hsu-Yuan (Grace) Fu
Email: hyf.ntu@gmail.com
臺大生化科技學系暨研究所博士。以蛋白質結構與功能為工具在微生物視紫紅質 (microbial rhodopsin) 的主題中取得學位。現於美國明尼蘇達大學 (UMN) 化學工程與材料科學系 (Department of Chemical engineering and Material Sciences) 擔任博士後研究員，以系統生物學 (system biology)、合成生物學 (synthetic biology) 與細胞工程 (cell engineering) 等技術，應用於生藥公司上游操作 (upstream processing) 的細胞株發展 (cell line development)。堅信 nature never lie but hide，正在繼續學習更多不同領域的工具，以求能更全面的看世界。

撰稿｜傅煦媛
編輯｜劉至堯、陳致曄
學術部負責人｜陳致曄

修訂｜任怡昕