腦膜是圍繞在大腦與脊髓外側、由四層膜 [1] 構成的結締組織，負責中樞神經系統抵禦傷害。然而腦膜不僅僅提供物理性保護功能而已，近年許多研究利用單細胞 RNA 定序鑑定了分布在腦膜上的細胞身份 [2]。腦膜除了受到三叉神經 [註1] 的傷害受器（nociceptor）[註2] 支配外，還富含多種免疫細胞，因此腦膜的神經─免疫交互作用在生理與病理所扮演的角色開始受到神經與免疫學家的密切關注。
註1：三叉神經為第五對腦神經，具有三個分支：眼分支、上頷枝與下頷枝，故命名為三叉神經。三叉神經屬於混合神經，含有感覺神經元與運動神經元，感覺神經元收集與傳導來自面部和頭部的感覺刺激訊號，運動神經元則控制咀嚼肌。三叉神經的眼分支支配到腦膜，可收集頭部的刺激訊號，因此在頭痛的病生理機制上扮演重要角色。
註2：傷害受器（nociceptor）是一種接受傷害刺激的感覺神經元
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細菌性腦膜炎是細菌入侵腦膜與大腦的疾病，若未及時治療，死亡率高達 30% [3]，即便是感染的存活者也可能產生神經相關的後遺症。然而，至今對於細菌如何攻破腦膜這道防線，直闖中樞神經系統的認知仍然相當有限，而分布於腦膜的免疫細胞是否在防禦病原菌入侵時發揮作用尚待深入研究。美國哈佛醫學院的科學家 Isaac Chiu 團隊於是著手進行細菌性腦膜炎的致病機制研究，並著眼於腦膜的神經─免疫交互作用如何誘發或抵禦細菌入侵大腦。
團隊首先利用靜脈注射二種常見的細菌性腦膜炎菌株—肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae；S. pneumoniae）及無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae; S. agalactiae）以建立感染模型，細菌可於注射後 6~12 小時入侵硬腦膜（dura）；注射後 24 小時可入侵內層腦膜（蛛網膜、軟腦膜）、脈絡叢（choroid plexus；ChP，血液-腦脊髓液屏障所在位置）及大腦組織（圖一 a-c）。為了探討傷害受器在細菌性腦膜炎中對宿主防禦功能所扮演的角色，作者將專一表現 Nav1.8 的傷害受器進行清除，結果顯示將傷害受器清除可減少兩種細菌入侵腦膜及大腦的量（圖一 d-f），表示傷害受器與細菌入侵中樞神經系統相關。
圖一、傷害受器調控細菌入侵中樞神經系統。a：透過靜脈注射肺炎鏈球菌及無乳鏈球菌建立細菌性腦膜炎動物模型；b-c： 注射肺炎鏈球菌與無乳鏈球菌後，在血液、硬腦膜（dura）、蛛網膜（Arach）、軟腦膜（pia）、脈絡叢（ChP）及大腦組織測得的細菌量；d：使用依賴 Cre 在傷害受器表達白喉毒素受體（DTA）的基因轉殖鼠，注射白喉毒素時可選擇性清除表現 Nav1.8 的傷害受器；e-f：選擇性清除傷害受器對二種細菌入侵血液、腦膜與腦組織的影響。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-023-05753-x
由於頭痛是細菌性腦膜炎的常見症狀，當傷害受器受到刺激時會釋放一種神經胜肽—降鈣素基因相關胜肽（calcitonin gene-related peptide; CGRP），藉此引發與頭痛路徑相關的神經核區活化，因此研究團隊在離體模式中，測試細菌感染小鼠後可否引發支配腦膜的三叉神經細胞活化並釋放 CGRP。結果顯示，二種細菌可使傷害受器的細胞內鈣離子濃度上升（圖二 a、c），並誘發支配腦膜的三叉神經釋放 CGRP（圖二 b、d），因此可知細菌感染可活化傷害受器，使其釋放與頭痛相關的神經胜肽 CGRP。
圖二、肺炎鏈球菌與無乳鏈球菌活化傷害受器並引發 CGRP 釋出。a： 肺炎鏈球菌、辣椒素（Capsaicin）與 KCl（正對照組）可引發傷害受器的細胞內鈣離子濃度上升；b：肺炎鏈球菌引發傷害受器釋放 CGRP。c： 無乳鏈球菌引發傷害受器的細胞內鈣離子濃度上升；d：無乳鏈球菌引發傷害受器釋放 CGRP。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-023-05753-x
CGRP 的受體是由 RAMP1（Receptor activity modifying protein 1）與 CRLR（calcitonin receptor-like receptor）兩種蛋白形成的複合體，研究團隊接著想釐清 CGRP 在細菌性腦膜炎中是否影響宿主的免疫防禦功能，因此利用 Ramp1 (RAMP1 的編碼基因) 基因剔除鼠、注射 CGRP 或 CGRP 拮抗劑（BIBN）探討 CGRP 的角色。結果顯示，相較正常小鼠，CGRP 受體剔除鼠（Ramp1-/-）的腦膜與中樞神經系統受細菌入侵的量較少（圖三 a），此結果與注射CGRP拮抗劑 BIBN 一致（圖三 e）。然而 CGRP 受體剔除鼠（Ramp1-/-）的腦膜上，在細菌感染後可測得較多的巨噬細胞（macrophage）與嗜中性球（neutrophil）（圖三 b）。反之，注射 CGRP 可使較多細菌入侵腦膜與中樞神經系統，同時會減少腦膜上的巨噬細胞與嗜中性球（圖三 c-d）數量，綜合這些結果可推論，CGRP 可抑制免疫細胞被召集到腦膜上，此舉將有利於細菌入侵中樞神經系統。
圖三、CGRP對細菌性腦膜炎的影響。a: 剔除CGRP受體對細菌入侵血液、腦膜與大腦的影響；b：剔除CGRP受體對感染後小鼠腦膜上的免疫細胞數量之影響；c：注射CGRP對細菌入侵血液、腦膜與大腦的影響；d：注射CGRP對感染後小鼠腦膜上的免疫細胞數量之影響；e：處理CGRP拮抗劑（BIBN）對細菌入侵血液、腦膜與大腦的影響。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-023-05753-x
作者接著利用單細胞 RNA 定序找出細菌性腦膜炎中分布於腦膜的免疫細胞身份，並分析其基因轉錄的變化。結果顯示細菌感染後，腦膜上數量最多的免疫細胞是巨噬細胞，若利用藥物將腦膜上的巨噬細胞清除，可減少入侵中樞神經統的細菌量，且在多種腦膜免疫細胞中，CGRP 受體的編碼基因表現程度最高，因此作者將焦點集中於腦膜巨噬細胞的 CGRP 受體。選擇性剔除腦膜巨噬細胞的 CGRP 受體（Pf4△Ramp1）可減少細菌入侵中樞神經系統（圖四 a）。作者接著在離體實驗中進行差異基因表達分析，結果顯示巨噬細胞在細菌感染後，趨化激素（chemokine）的基因表現量上升，但與抑制發炎相關的基因表現量下降；然而巨噬細胞在細菌感染同時處理 CGRP 的情況下，趨化激素或促發炎因子的基因表現會受抑制（圖四 b）。在趨化激素的 mRNA的 表現量上也呈現相同趨勢，細菌感染可增加巨噬細胞中趨化激素與促發炎因子的mRNA表現，此現象在同時處理CGRP的情況下會受到抑制，而CGRP受體下游的訊息傳遞路徑是 cAMP/PKA，若同時處理 CGRP 與 PKA 抑制劑（PKAi），則可抑制 CGRP 作用（圖四c）。
在活體感染模式中也獲得一致的結果，CGRP 處理後，小鼠腦膜免疫細胞數量受影響程度最大的是巨噬細胞（圖四 d），且 CGRP 抑制了感染後與趨化作用及免疫反應相關的基因表現（圖四 e-f）；若選擇性剔除腦膜巨噬細胞的 CGRP 受體，可增加趨化激素與促發炎因子的 mRNA 表現量及腦膜上的嗜中性球與單核球數量（圖四 g-h）。由這些結果可推論，細菌感染後，腦膜巨噬細胞的 CGRP 受體活化可抑制宿主的免疫反應，因此將有利於細菌入侵中樞神經系統。
圖四、腦膜巨噬細胞的 CGRP 受體活化可抑制宿主的防禦系統。a ：選擇性剔除腦膜巨噬細胞的 CGRP 受體（Pf4△Ramp1），可抑制細菌入侵血液、腦膜與大腦；b：運用離體實驗模式，進行受細菌感染及細菌感染同時處理 CGRP 的腦膜巨噬細胞差異基因分析；c：以即時定量聚合酶連鎖反應分析受細菌感染、細菌感染同時處理 CGRP，以及細菌感染同時處理 CGRP + PKA 抑制劑（PKAi）對趨化激素與促發炎因子的 mRNA 表現情形；d：以單細胞 RNA 定序分析感染腦膜炎與腦膜炎同時處理 CGRP 的小鼠腦膜細胞族群差異；e-f：針對感染腦膜炎與感染腦膜炎同時處理 CGRP 的小鼠腦膜巨噬細胞進行基因功能分類與表現程度分析；g-h：選擇性剔除腦膜巨噬細胞的 CGRP 受體，對趨化激素與促發炎因子的mRNA表現量與分布在腦膜的免疫細胞數量的影響。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-023-05753-x
綜合上述實驗結果，研究團隊推論，腦膜上的傷害受器受到傷害刺激時會釋出CGRP，這些釋出的 CGRP 可活化腦膜巨噬細胞的 CGRP 受體，並啟動下游的 cAMP/PKA 訊息傳遞路徑，藉此抑制趨化激素與促發炎因子的表現，因此可抑制免疫細胞被召集到腦膜上；而細菌透過活化傷害受器，刺激 CGRP 的釋出，並藉由 CGRP 的作用抑制宿主的免疫反應，如此一來便有利於細菌入侵中樞神經系統（圖五）。本篇研究指出傷害受器不僅負責傳導傷害刺激引發的疼痛訊號，更透過神經胜肽 CGRP 的釋放，控制腦膜上的免疫細胞活性。團隊表示，未來研究方向可針對傳導體感覺的傷害受器開發治療細菌性腦膜炎的方法。
圖五、細菌劫持腦膜神經免疫軸的機制示意圖。腦膜的傷害受器接受刺激後可釋放CGRP，藉此活化腦膜巨噬細胞的 CGRP 受體，並啟動 cAMP/PKA 訊息傳遞路徑抑制趨化激素的表現，藉此抑制更多白血球進行宿主防禦，細菌劫持了大腦邊疆的防禦機制，此舉將有利於入侵中樞神經系統。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-023-05753-x
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撰文｜劉姿婷
審稿｜蔡宗霖
