造血幹細胞（hematopoietic stem cells）具有自我更新能力與分化為多種細胞譜系的潛能，生成體內的血液與免疫細胞（圖一）。若是造血過程受到阻滯、或是發生癌化現象，則可能影響患者特定細胞譜系的發育與成熟，進而導致相關的免疫作用或血液功能發生變異。
圖一、造血幹細胞分化為多樣的血液與免疫細胞譜系。 （A）一般認知的造血幹細胞分化譜系圖，由多能性（multipotent）的造血幹細胞衍生出各個細胞譜系的過程，分化潛能逐步降低、並趨向特定細胞命運（cell fate）。（B）則是整合單細胞流式細胞技術與轉錄體分析，說明骨髓中造血幹細胞分化過程實際上未有明確的階層劃分，而是受到不同基因調控交互作用下連續漸變的過程。
圖片來源： （A）Murphy, K., & Weaver, C. (2015). Janeway’s Immunobiology. Garland Science. （B）https://www.nature.com/articles/ncb3493
異體造血幹細胞移allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT）是再生醫學上重要的療法（圖二），應用於諸多血液性癌症與免疫相關病症的治療已逾六十年 [1]，許多研究亦致力於改善療法的預後，降低疾病後續復發的可能；亦透過評估捐贈者細胞的嵌合程度（donor cell chimerism），作為追蹤 allo-HSCT 移植成效與惡性腫瘤復發的指標，以調整後續介護療法 [2]。然而對於移植手術後，患者體內血液與免疫細胞的重建（reconstitution）過程，瞭解仍不甚透徹。以中國醫學科學院與北京協和醫學院為首的研究團隊，利用單細胞 RNA 定序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技術，持續追蹤並解析移植後超過 180 天的細胞動態變化，研究成果於今年初發表於 Science Immunology [3]。
圖二、造血幹細胞移植（HSCT）是細胞療法的重要途徑，可作為免疫療法或再生醫療之用。 HSCT 成功的關鍵，主要取決於造血幹細胞是否能使宿主的造血系統再生，以及來自捐贈者的異體細胞是否會引起宿主體內的免疫反應：在免疫治療上可運用移植物引起的免疫作用，對抗血癌或感染；另一方面，異體細胞也可能誘發宿主體內免疫反應，引致移植物抗宿主疾病（graft-versus-host disease, GVHD）或排斥現象。
圖片來源：https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.aap9630
再生不良性貧血（aplastic anemia, AA）屬於骨髓性衰竭疾病（bone marrow failure disease），患者骨髓中多種血液與免疫細胞譜系數量減少（pancytopenia），卻也因此提供了深入研究移植後造血細胞重組情形的契機。團隊首先針對十名接受異體周邊血液幹細胞移植（allogeneic peripheral blood stem cell transplantation, allo-PBSCT）治療的 AA 患者，進行單細胞 RNA 定序，分析所移植的造血幹細胞與總體帶核細胞（total nucleated cells, TNCs）的轉錄體，探討參涉造血系統重建過程的調控機轉。
研究利用流式細胞儀偵測細胞表面抗原，分選來自捐贈者移植物與患者骨髓的造血幹細胞與前驅細胞（hematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs），進行單細胞標記反轉錄 RNA 定序（single-cell tagged reverse transcription RNA sequencing, STRT-seq）[4]；另一方面，收集來自捐贈者與患者的骨髓與周邊血液樣本，裂解紅血球後進行 10x Genomics scRNA-seq 樣本製備。團隊分析了超過一萬個細胞，在每個細胞中測得約六千個基因，參照過往研究中恆定狀態下 HSPC 的基因體資料，進一步將其分為 10 個細胞群落（clusters）：造血幹細胞與多能性前驅細胞（HSC/MPP）、淋巴細胞譜系趨向多能性前驅細胞（LMPP）、多能性淋巴前驅細胞（MLP）、B 細胞與自然殺手細胞前驅細胞（BNK）、巨核細胞與紅血球前驅細胞（MEP）、嗜酸性球及嗜鹼性球與肥大細胞前驅細胞（EBM）、顆粒球與單核球前驅細胞（GMP）、單一潛能嗜中性球前驅細胞（NeP）、單核球與樹突細胞前驅細胞（MD）、以及基質細胞（stromal cell）（圖三）。
圖三、運用單細胞定序分析 allo-PBSCT 後的動態造血系統重建過程。 （A）研究方法概覽。十名再生不良性貧血（AA） 患者經過免疫調節後進行 allo-PBSCT，後續追蹤並收集骨髓與周邊血液樣本、以及來自捐贈者之相對應移植物（周邊血液幹細胞, G-PBSC），進行 scRNA-seq。（B）以 UMAP 降維並呈現 Lin- [CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56], CD34+（排除成熟淋巴譜系、並保留具有幹細胞特性的細胞）組成，分為十個細胞群落。（C）於移植後不同時間點追蹤造血幹細胞與前驅細胞（HSPC）組成的變化。（D）分析總體帶核細胞（TNC）組成，分為八個細胞群落。（E）定量移植後不同時間點總體帶核細胞（TNC）組成的變。
圖片來源：https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abn6429
接下來，團隊探討 allo-PBSCT 後的造血系統重建過程，比較各個細胞群的動態組成。在移植後 30 天內，捐贈者與患者相比，細胞組成變異量差異不大：第一天所收集的 HSPCs 以具多能性的 HSC/MPP、LMPP、與 MEP 為主，第 14 天與第 30 天所取得樣本大致相似，然有較高量的 GMP、MD、NeP，逐漸走向細胞譜系特化。在移植後第 60 天及第 90 天的細胞組成則有較大分歧，主要發生於 BNK 等淋巴細胞譜系。團隊亦應用 FateID [5] 追蹤細胞組成的動態變化，定量前驅細胞轉錄體中細微的差異與傾向特別細胞命運的可能性，進而推導細胞發育的可能軌跡。發現恆定狀態下，前驅細胞同時分為下游成細胞然植後第一天的 HSPC 明顯較傾向於分化為 MEP，再生血液細胞，第 14 天時則傾向 NeP、MD、與 BNK 等細胞命運。此外，分析總體帶核細胞（TNC） 則將其細分為八個細胞群落，其中，嗜中性球的各個分化階段也與過往研究大致吻合（圖四）。
圖四、以表面抗原表現量與流式細胞技術鑑別嗜中性球細胞的分化階段。 （A）以多種表面抗原表現量變化定義出不同分化階段，大致對應組織染色所分辨出的各種細胞型態。（B）運用流式細胞儀分析，逐步分離出骨髓中的嗜中性球前驅細胞直至成熟細胞的各個階段，依為 ProNeu、PreNeu、ImmatureNeu以 MatureNeu。（C）利用（B）的分選策略，自周邊血液分離出不同分化階段嗜中性球的細胞型態。
圖片來源： （A）https://doi.org/10.1016/j.immuni.2020.07.017 （B）https://doi.org/10.1016/j.immuni.2020.06.005 （C）https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abn6429
進行移植後，患者體內的成熟血液與免疫細胞的生成多仰賴捐贈者的 HSCs，因此團隊也解析了 HSC/MPP 的組成，再細分為三群。檢視其細胞譜系趨向情形（lineage priming）與細胞週期狀態，發現相較於穩定狀態下的 HSCs 僅有約 5% 細胞處於 S 與 G2/M 期，移植後第一天的 HSC/MPP1-3 中約有 40 ~ 60% 細胞處於 S 與 G2/M 期；此外，HSCs 在移植後第一天的細胞譜系趨向分化為紅血球，也解釋了前述實驗中 MEP 數量的增加，第 30 天時則趨向巨核細胞、淋巴細胞、與髓系細胞，至第 60 天與第 90 天時則越發不傾向分化為紅血球（圖五）。
圖五、將造血幹細胞與多能性前驅細胞（HSC/MPP）細分為三個群落。
（A）UMAP 呈現 HSC/MPP1-3 分群。（B）穩定狀態下，不同 HSC/MPP 群落中的幹細胞特性與多個細胞譜系趨向程度。（C）幹細胞特性與細胞譜系特化生物標記的增益（enrichment）程度；圓圈大小與色彩分別代顯著程與標化增程度normalized enrichment score, NES）。（D）透過轉錄體分析細胞週期，比較不同 HSC/MPP 處於 S 與 G2/M 期的細胞比例。
圖片來源：https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abn6429
嗜中性球在 HSCT 早期對於宿主的免疫作用中扮演重要角色，分析總體帶核細胞（TNC）時也發現在移植初期出現如 ProNeu 與 PreNeu 等大量嗜中性球前驅細胞（圖三），意味著可能發生緊急顆粒球生成現象（emergency granulopoiesis），團隊進而將 GMP 與 NeP 區分為不同細胞亞群，並分析細胞譜系標記與基因表現情形。
比較穩定狀態與 allo-PBSCT 後的細胞組成，則發捐贈者經 G-CSF 驅（granulocyte colony-stimulating factor mobilization）後 S100Ahigh Neu1 與 Neu2 的細胞大幅增加，並可於移植後維持 180 天以上。團隊藉由基因功能分析，發現在 S100Ahigh Neus 中與成熟嗜中性球生物功能相關的生物途徑發生增益，S100Ahigh Neu2 則可能參與免疫抑制調控與細胞因子生成等作用。接下來，團隊利用免疫分型與細胞型態分析了解 S100Ahigh Neus 成，推測與移植的患者預後相關，並以流式細胞儀量測移植物中 S100Ahigh Neu2 的數量，持續追蹤長達 100 天並進行臨床評估，發現未發生急性 GVHD（acute GVHD, aGVHD）患者帶有較多 S100Ahigh Neu2。探討 PreNeu 與 S100Ahigh Neu2 的基因表現情形，則發現兩者與嗜中性球前驅細胞相關的基因表現量均較高，G-CSF 驅動後的 PreNeu，顆粒酶（granzyme）與免疫系統相關調控基因皆上調（圖六）。
圖六、GMP 與 NeP 的組成與 S100Ahigh Neu 細胞亞群鑑測。 （A）以 UMAP 呈現 GMP 與 NeP 的細胞群落。（B）各細胞群落中與嗜中性球功能相關基因與生物標記表現程度。（C）NeP 細胞群落在健康對照組、捐贈者、與患者的分群現象明顯不同。（D）比較 NeP 與 S100Ahigh Neu2 差異表現基因（differentially expressed genes, DEGs）並進行基因功能暨生物途徑增益分析。（E）未發生 aGVHD 患者中具有較高量的 S100Ahigh Neu2。
圖片來源：https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abn6429
整體而言，此研究以單細胞定序方法解析移植後造血系統再生與重建的過程，追蹤了自造血幹細胞與多能性前驅細胞（HSC/MPP）至下游的成熟血液與免疫細胞的動態變化，並透過流式細胞技術與轉錄體分析，進一步鑑定了嗜中性球細胞亞群，發現 S100Ahigh Neu2 可能與患者預後與急性移植物抗宿主疾病（aGVHD）相關。
一篇 2022 年發表於 Nature Immunology 的研究 [6] 亦指出，造血幹細胞移植（HSCT）後嗜中性球快速重建造血系，與患者的後與存活形相關。此，也透過錄體分析發現受 G-CSF 驅動的捐贈者與移植患者嗜中性球前驅細胞與生物功能基因均上調，且移植後患者血液中干擾素（interferon）含量急性增加，並促進嗜中性球的相關基因表現。嗜中性球對於外來刺激的快速反應也體現在基因表現層次，故未來可望運用轉錄體分析，協助衡量臨床指標；單細胞定序技術的應用，也利於釐清不同細胞群落與狀態，進行功能鑑別與研究。
Investigator 選文｜Collection: Stem cells from development to the clinic | Nature Portfolio
Investigator 選文｜Bone Marrow Transplantation: Past, Present and Future | Edward Donnall Thomas (Nobel Lecture 1990)
延伸閱讀｜Investigator：Single-cell analysis 選文
參考文獻：
[1] Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., & Ferrebee, J. W. (1957). Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. New England Journal of Medicine, 257(11), 491-496. https://doi.org/10.1056/nejm195709122571102
[2] Tozzo, P., Delicati, A., Zambello, R., & Caenazzo, L. (2021). Chimerism monitoring techniques after hematopoietic stem cell transplantation: An overview of the last 15 years of innovations. Diagnostics, 11(4), 621. https://doi.org/10.3390/diagnostics11040621
[3] Huo, Y., Wu, L., Pang, A., Li, Q., Hong, F., Zhu, C., Yang, Z., Dai, W., Zheng, Y., Meng, Q., Sun, J., Ma, S., Hu, L., Zhu, P., Dong, F., Gao, X., Jiang, E., Hao, S., & Cheng, T. (2023). Single-cell dissection of human hematopoietic reconstitution after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Science Immunology, 8(81). https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abn6429
[4] Islam, S., Kjällquist, U., Moliner, A., Zajac, P., Fan, J. B., Lönnerberg, P., & Linnarsson, S. (2011). Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome research, 21(7), 1160–1167. https://doi.org/10.1101/gr.110882.110
[5] Herman, J. S., Sagar, & Grün, D. (2018). FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data. Nature methods, 15(5), 379–386. https://doi.org/10.1038/nmeth.4662
[6] Montaldo, E., Lusito, E., Bianchessi, V., Caronni, N., Scala, S., Basso-Ricci, L., Cantaffa, C., Masserdotti, A., Barilaro, M., Barresi, S., Genua, M., Vittoria, F. M., Barbiera, G., Lazarevic, D., Messina, C., Xue, E., Marktel, S., Tresoldi, C., Milani, R., Ronchi, P., … Ostuni, R. (2022). Cellular and transcriptional dynamics of human neutrophils at steady state and upon stress. Nature immunology, 23(10), 1470–1483. https://doi.org/10.1038/s41590-022-01311-1
撰文｜陳品萱
審稿｜藍冠鈞
