收縮性注射系統（Contractile Injection Systems，簡稱 CISs）廣泛存在於某些細菌及古細菌中，其特性為該細菌會分泌帶有類噬菌體尾端的結構並幫助細菌將自身蛋白質或遺傳物質傳遞進宿主細胞。其中，細胞外收縮性注射系統（extracellular Contractile Injection System，簡稱 eCIS）因為可在細胞外實現物質傳遞的功能，因而受到許多研究團隊的重視。目前已有研究顯示 eCIS 可幫助細菌分泌目標物（例如至受測細胞並進而影響該細胞的功能 [1]。
eCIS 系統由一群蛋白質複合物所組成，包括收縮性鞘（sheath）、尖刺狀蛋白（spike）、長尾纖維（tail fibers）和基座複合體（baseplate）（圖一a）。本研究使用昆蟲病原菌-非共生光桿菌（Photorhabdus asymbiotica）的一種 eCIS 系統：photorhabdus virulence cassette (PVC) 為例，將其基因座拆成兩個片段並經由電穿孔送入大腸桿菌表現（圖一b），透過電子顯微鏡觀察發現大腸桿菌能成功表現這兩個片段並形成 eCIS 結構的蛋白複合體（圖一c）。接著，研究團隊更進一步測試這些純化出的 eCIS 是否能夠將蛋白質傳遞至受測細胞中。他們將重組酶 Cre蛋白接合至 eCIS 結構，與帶有 Cre 報導系統：loxP-GFP（綠色螢光蛋白，Green Fluorescent Protein）片段的 Sf9 胞同養證 PVCs 確實能夠將 CRE 傳遞至細胞內，並辨識細胞內的 loxP 片段後而進行剪切反應，因而使細胞能夠表現出 GFP 訊號（圖一d）。
圖一、PVC 可以藉由大腸桿菌（E.coli）表現並形成 eCIS 複合體。a. P. asymbiotica 基因座的示意圖包含 16 個結構和輔助基因（分別以藍色和紫色表示）以及兩個載體基因（以紅色表示），以及四個推測的調控基因（以橙色表示）。PVC 的插圖為示意圖，並未按照比例繪製。b. PVCs 製備流程圖。c. PVC 顆粒的電子顯微鏡圖。d. PVCs 可以將重組酶 CRE 傳遞細胞，並識細內的 loxP 片段後而進行剪切反應，因此可以利用免疫螢光染色偵測到 GFP 訊號（比例尺為 200 μm）。pvc13（tail fibre）為推測的目標辨識基因（target recognition gene），影響 PVC 辨識宿主細胞。 pvc15 (ATPase) 為裝載基因（payload loader gene，影響目標蛋白質包入 PVCs 顆粒中。
（圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7）
從過去的研究中得知嗜菌體的長尾纖維通常可和真核病毒上的特定受體（receptors）結合，因為 PVCs 和嗜菌體有許多類似的特性，因而推測 PVCs 的長尾纖維可能也和目標特異性（specificity）有關。為了要驗證這個假說，研究團隊在 HEK 293FT 細胞中建構了帶有蛋白標籤（protein tags）的抗體作受體表現在細胞膜外，並將 PVC 的長纖維基因序列加上不同的蛋白標籤序列，來驗證長尾纖維與其目標受體之間的交互作用。結果發現，只有 PVC 長尾纖維表現相對應的蛋白標籤才能夠辨識表現在細胞株上的抗體並產生 GFP 訊號，這證明藉由 PVCs 作為傳遞物質的手段對細胞具有高度特異性，而這樣的特性大大提升 PVCs 作為分子注射器的可能性，除了更加精準的辨識目標細胞外還降低脫靶效應（圖二）。
圖二、PVC 經 pvc13 區域（tail fibre可以辨不同的體表現 HEK293FT 人類細胞中。 a. 實驗示意圖。b. 免疫螢光染色結果及 GFP 定量圖。比例尺為 500 μm。
（圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7）
為了要瞭解 PVCs 最終是否可用於人體，研究團隊以小鼠為實驗對象，利用 PVCs 進行蛋白質傳遞。首先利用 AlphaFold 針對 PVC 長尾纖維進行結構預測與改良，使得 PVCs 可以針對小鼠細胞進行蛋白質傳遞。結果發現，將 PVCs 注射至顱內後，海馬迴出現 tdTomato 紅光訊號，表示即使在體內，PVCs 仍然能夠確實地將重組酶 CRE 傳遞至細胞內，並辨識細胞內的 loxP 片段進行剪切反應，因而使細胞表現出 tdTomato 紅光訊號(圖三a)。此外，利用流式細胞分析發現只有神元細胞 tdTomato 紅光訊號，而神經膠細胞並沒有，表示 PVCs 即使在體內也具有細胞特異性（圖三b）。另外也發現，給予老鼠 PVCs 後並未引起免疫細胞的活化，也沒有發生發炎反應、體重減輕和毒性反應，這表明 PVCs 的治療在此實驗時間內是安全的（圖三c）。至於 PVCs 於活體內的存在時間，從電子顯微鏡觀察得知 PVCs 只會在前期會被偵測到（第0~1天），並不會長時間存在腦組織中（圖3d）。
圖三、小鼠實驗證明可利用 PVCs 傳遞目標蛋白質至特定細胞中。a.左圖為透過PVCs傳遞蛋白質至小鼠腦的實驗流程圖。右為攜帶 Pvc13-Ad5-knob(RGD/PK7) 的 PVC 在帶有 loxP-tdTomato 小鼠的海馬迴區產生 tdTomato 訊號。當 pvc10（spike tip protein）基因缺失時，螢光消失，表示觀察到的 tdTomato 訊號是由 PVCs 所引起的。白色箭頭標示注射點。比例尺為 500 μm。b.從小鼠腦組織中分離出單細胞並用流式細胞儀分析 tdTomato 螢光發現 PVCs 存在於神經細胞而非神經膠細胞（MFI, meanfluorescence intensity，平均螢光強度）。c.腦內PVCs 注射不會引起免疫細胞向中樞神經系統（CNS）遷移，表示免疫系統並沒有被活化。d.電子顯微鏡觀察 PVCs 顆粒只存在於第0-1天，並不會長時間持續存在腦組織中。
（圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7）
綜合以上研結果，PVCs 可以安全、有效且精準地在小鼠體內進行蛋白質傳遞，這對未來的基因療法和蛋白質藥物遞送系統的開發帶來新的可能性。
源於細菌的蛋白質收縮注射系統示意圖。
（圖片來源：https://doi.org/10.1038/d41586-023-00847-y）
Main Article:
Kreitz, J., Friedrich, M.J., Guru, A. et al. Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system. Nature 616, 357–364 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7
參考文獻：
- Rocchi, I., Ericson, C. F., Malter, K. E., Zargar, S., Eisenstein, F., Pilhofer, M., Beyhan, S., & Shikuma, N. J. (2019). A Bacterial Phage Tail-like Structure Kills Eukaryotic Cells by Injecting a Nuclease Effector. Cell reports, 28(2), 295–301.e4. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.06.019
撰文｜蔡伊婷
審稿｜黃云宣
