細胞正常生理作用機制有賴代謝循環的嚴格調控，這些代謝產物也與轉錄因子、磷酸激酶等調控有關，最為人熟知的或許就是原核生物中的乳糖操控組，在人體中代謝體與蛋白體的交互作用更加豐富。然代謝產物在胞內生理濃度往往不高、與目標蛋白結合後其胞內濃度也只會有微小差異，造成實驗上的困難。美國猶大醫學院（University of Utah School of Medicine）帶領的研究團隊運用了基本的平衡透析原理，搭配精準的質譜儀定量方法，能量化在不同情況下微小的代謝物濃度差異，因此能找出與目標蛋白結合的代謝物，進而進行後續機制驗證。
研究團隊設計出由半透膜相隔的兩室（圖一），起初一室（P室）中有目標蛋白、另一室（M室）為混合代謝物溶液，半透膜的設計僅能讓代謝物自由擴散（diffusion），但蛋白無法移動，在放置一定時間後，代謝物或許會移動往 P 室與目標蛋白結合，而兩室在溶液中的代謝物濃度將達平衡等量。接著將 P 室中目標蛋白移除，使得原先與之結合的代謝物回歸溶液，因此若有代謝物在 P 室與此目標蛋白結合，則 P 室的該代謝物濃度會較 M 室高，此差異最後能透過質譜儀定量而得。此方法定名為 MIDAS（mass spectrometry integrated with equilibrium dialysis for the discovery of allostery systematically）。
圖一、MIDAS方法簡圖。Pc：目標蛋白室、Mc：混合代謝物室。圖片來源：https://doi.org/10.1126/science.abm3452
在本研究中，團隊聚焦於三羧酸循環（TCA cycle，tricarboxylic acid cycle）、糖質新生（gluconeogenesis）、糖解作用（glycolysis）等醣質相關的 33 種酵素，以 MIDAS 方法找到逾 830 個可能的代謝物與蛋白的交互作用。其中不乏已知作用，如葡萄糖-6-磷酸異構酶glucose-6-phosphate isomerase，GPI）與其受質（substrate）葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate）、果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate）的結合（圖二）。
糖解作用的終產物丙酮酸（pyruvate）除了能進入檸檬酸循環產製 ATP 之外，亦可以被乳酸去氫酶（LDH，Lactate dehydrogenase）還原成乳酸、協同作用為 NADH 氧化成NAD，一般情況下 TCA 循環和 LDH 的兩路徑彼此競爭丙酮酸的使用，而由於 LDH 的催化為可逆反應，在缺氧情況下 TCA 循環受限，會導致 NAD 的合成不足，LDH 則需逆向使用乳酸產生 NAD。近期更有研究顯示，乳酸亦可是 TCA 循環的主要碳來源 [2]，可見得 LDH 是醣類代謝的一重要調控酵素。
圖二、糖解作用與 TCA 循環。本圖顯示不同路徑之間代謝物與相關酵素的交互作用。代謝物顏色：白色為未在本研究初步篩選清單中的代謝物、灰色為具異構物的代謝物，黑色反之。圖片來源：https://doi.org/10.1126/science.abm3452
LDH 有兩個蛋白異構體（isoform）：LDHA 和 LDHB，透過 MIDAS 方法顯示出有不少與之結合的代謝物，諸如已知的受質 NAD、NADH [註一] 及其結構相似物、競爭性抑制物（competitive inhibitor）草醯乙酸（oxaoloacetate）、酮酸類（keto acids）、腺苷酸（adenosine nucleotide）、輔酶A（coenzyme-A，CoA）衍伸物。
[註一] NAD：菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamide adenine dinucleotide，還原態常表示為 NADH + H+
在這些代謝物中，研究團隊選擇以不同鏈長的脂肪酸輔酶 A 衍生物深入探討 LDHA 和 LDHB 是否對其有不同的結合傾向及反應。首先他們發現棕櫚醯輔酶A（palmotiyl-CoA，C18:1-CoA）抑制 LDHA 活性（圖三 A），但對 LDHB 不具有抑制性（圖三 B）。進一步透過碳 13 同位素標定追蹤相關代謝產物，在施加棕櫚酸使細胞能產生棕櫚醯輔酶 A 的狀況下，當細胞只剔除了 Ldhb 基因時（Lhdb -/-，亦即此時細胞只有 LDHA），並不影響乳酸去氫酶催化丙酮酸和乳酸的轉換，而當細胞剔除了 Ldha 基因，不論為單剔除（Ldha-/-）或雙剔除（Ldha -/-, Lhdb -/-），該代謝路徑都因添加了棕櫚酸而受抑制（圖三 C-F），支持了先前棕櫚醯輔酶 A 對 LHDA 的專一抑制結果。
圖三、（A、B）不同輔酶 A 衍生物對 LDHA、LDHB 的抑制效果。（C、D）透過帶有 C13 標定葡萄糖追蹤乳酸含量， C 圖為葡萄糖轉化為乳酸的路徑簡圖；D 圖為不同基因剔除組別中帶有同位素標定的乳酸含量。（E、F）透過帶有 C13 標定乳酸追蹤葡萄糖含量， E 圖為乳酸轉化為葡萄糖的路徑簡圖；F 圖為不同基因剔除組別中帶有同位素標定的葡萄糖含量。EC：胞外（extracellular）、IC：胞內（intracellular）、BSA：牛犢血清蛋白（Bovine Serum Albumin）控制組、Pal：棕櫚酸實驗組。圖片來源：https://doi.org/10.1126/science.abm3452
本研究一大亮點在於 MIDAS 方法的建構，利用了質譜儀精準定量的優勢能探測到微小的差異，藉此找出與代謝體結合的蛋白，不僅限於已知的代謝物與目標蛋白的交互作用，MIDAS 篩選也找出了未知的潛在交互作用，顯示其能作為未來建構作用體（interactome）、系統性了解代謝物調控蛋白功能及路徑的方法之一。
參考文獻：
- Hicks, K. G., Cluntun, A. A., Schubert, H. L., Hackett, S. R., Berg, J. A., Leonard, P. G., … & Rutter, J. (2023). Protein-metabolite interactomics of carbohydrate metabolism reveal regulation of lactate dehydrogenase. Science, 379(6636), 996-1003. https://doi.org/10.1126/science.abm3452
- Hui, S., Ghergurovich, J., Morscher, R. et al. Glucose feeds the TCA cycle via circulating lactate. Nature 551, 115–118 (2017). https://doi.org/10.1038/nature24057
撰文｜黃云宣
審稿｜劉姿婷
