酵母菌出奇招：透過代謝轉換及提供細胞內還原環境以因應 DNA 複製壓力

DNA 複製是生物體維持各種生理機能的基礎，在過程中容易受到物理上及化學上的阻礙，例如染色質結構異常、蛋白質阻礙、正在進行轉錄的基因、抑或是由於致癌基因活化導致的活性氧化物（reactive oxygen species; ROS）產生的 DNA 傷害（DNA damage） [1]，這些阻礙被稱為複製壓力 （replication stress）。由此可知，ROS 所調控的細胞內氧化還原狀態（redox state）的平衡在 DNA 複製過程扮中演重要角色新聞將介紹中國深圳大學的團隊探究酵母菌中氧化還原環境對 DNA 複製壓力反應（replication stress response）活化影響的研究。

在 2017 年，深耕於 DNA 複製領域研究已久的丹麥哥本哈根大學 Jiri Lukas 教授已用實驗證實，在人類癌細胞株中，以過氧化氫（hydrogen peroxide； H₂O₂）造成的氧化壓力會使調控 DNA 複製前進的重要蛋白 Timeless 被迫脫離染色質，進而使 DNA 複製速度下降，使基因組趨於不穩定，彰顯了氧化與還原環境的平衡之於 DNA 複製調控的重要性 [2]

為了更深入探討此研究議題，深圳大學的研究團隊首先從代謝角度著手。團隊以經過複製壓力處理的酵母菌進行代謝體學分析（metabolome），並針對不同代謝路徑的產物進行量化。結果顯示，經過給予羥基尿素（hydroxyurea；HU）造成複製壓力後，酵母菌有較多的 6-磷酸葡萄糖酸（6-phosphogluconate; 6PG)，此為五碳醣磷酸路徑（pentose phosphate pathway; PPP）的中間產物之一；此外團隊更發現經過複製壓力後，酵母菌有較少的乙醯輔酶 A（acetyl-CoA），此為醣解作用（glycolysis）的中間產物之一（圖一），以上線索表明，複製壓力會改變酵母菌中主要使用的代謝路徑。

為了讓研究更聚焦，團隊透過生物資訊分析鎖定了潛在調控 6PG 產出以及 G6PD（調控 6PG 產生的酵素）表現的兩個重要因子，分別是 Mig1 以及 Snf1。Mig1 屬於抑制型轉錄因子（transcriptional repressor），而 Snf1 可以正向調控 Mig1。團隊透過基因表現定量分析 G6PD，發現酵母菌的 Snf1 突變株在經過複製壓力後，G6PD 表現量大幅下降；然在酵母菌的 Snf1 及 Mig1 雙突變株中，G6PD 表現量則與野生型無異，暗示了在複壓力存在情下酵菌 Snf1 會與 Mig1 作用，使 Mig1 的抑制特性降低，進而促進 G6PD 的表現。

細胞為了因應複製壓力可能帶來的 DNA 傷害，壓力會引發蛋白質間的訊息傳遞，以中止 DNA 複製，並進行 DNA 修復，此稱為 DNA 複製檢查點（replication checkpoint）。在酵母菌的複製檢查點中，蛋白質激酶 A（protein kinase A）會結合在單股 DNA 上（可能為正在進行複製的 DNA，也有可能是單股 DNA 斷裂），以避免單股 DNA 被分解，RPA 蛋白（replication protein A）會再將訊息傳遞給 Mec1 （哺乳動物中的 ATR）、Mrc1（哺乳動物中的 Claspin）、以及 Rad53（哺乳動物中的 Chk1），以確保複製檢查點的活化 [3]。因此，為了觀察 Snf1 與 Mig1 缺失情況下對 DNA 複製壓力反應的影響，團隊檢測了複製檢查點的活性化。結果顯示，Snf1 的酶活區域domain）如果缺失，在複製壓力情況下會導致 RPA 無法正常與單股 DNA 結合，且 Mec1 與 Rad53 無法正常被磷酸化，但若 Mig1 與 Snf1 激酶活性區域同時缺失，則可以使複製檢查點回復至與野生型無異，顯示 Snf1 的功能與 Mig1 拮抗，並可以正向調控 DNA 複製檢查點。

延伸閱讀｜DNA複製哨兵：Cdc7與CK1γ1共同調控Claspin並守護DNA複製

在這篇研究的最後，團隊將觸角延伸至 PPP 路徑的主要產物：NADPH 與核糖-5-磷酸 （R5P），而這些產物是醣解作用無法產生的。團隊實驗結果顯示，複製壓力處理後，野生型酵母菌中的 R5P 含量與 NADPH/NADP+ 比例都顯著上升（圖二 A）。由於 NADPH 是一個效果極佳的還原劑，因此團隊認為 NADPH 的功能可能是為細胞提供一個適當的還原環境（reducing environment），進而支持複製檢查點的活化。為了檢測還原環境的假設，團隊在酵母菌 Snf1 突變株培養時，加入了具強還原劑效果的α-酮戊二酸（α-ketoglutarate；α-KG），發現原本無法與單股 DNA 結合的 RPA、無法被正常磷酸化的 Rad53 蛋白都恢復到與野生型接近的水準（圖二 B-C），證實細胞內氧化還原環境的平衡對 DNA 複製壓力反應與檢查點至關重要。

透過上述的實驗證據，團隊認為酵母菌在複製壓力的情況下， Snf1 會與 Mig1 作用，並降低 Mig1 的抑制特性，進而促進 G6PD 的表現與 NADPH 的產生，此為細胞提供了適當的還原環境，使 DNA 複製檢查點可以順利活化，並進而穩定基因組（genome stability）（圖三）。有趣的是，在 2018 年的一篇研究中，Snf1 也被認為可以在葡萄糖缺乏（被認為是複製壓力的來源之一）的情況下，針對 Mrc1 進行磷酸化，以避免 DNA 斷裂並維持基因組的穩定性 [4]。因此，若能透過不同角度持續對 DNA 複製進行研究，將有助於窺探並解開基因組的奧秘！

延伸閱讀｜2021 年 5 月 DNA 複製主題月

Main Article: Li, L., Wang, J., Yang, Z., Zhao, Y., Jiang, H., Jiang, L., … & Lou, H. (2022). Metabolic remodeling maintains a reducing environment for rapid activation of the yeast DNA replication checkpoint. The EMBO Journal, 41(4), e108290. https://doi.org/10.15252/embj.2021108290

參考文獻：

1. Gaillard, H., García-Muse, T., & Aguilera, A. (2015). Replication stress and cancer. Nature Reviews Cancer, 15(5), 276-289. https://doi.org/10.1038/nrc3916
2. Somyajit, K., Gupta, R., Sedlackova, H., Neelsen, K. J., Ochs, F., Rask, M. B., … & Lukas, J. (2017). Redox-sensitive alteration of replisome architecture safeguards genome integrity. Science, 358(6364), 797-802. http://doi.org/10.1126/science.aao3172
3. Hsiao, H. W., Yang, C. C., & Masai, H. (2021). Roles of Claspin in regulation of DNA replication, replication stress responses and oncogenesis in human cells. Genome Instability & Disease, 2(5), 263-280. https://doi.org/10.1007/s42764-021-00049-8
4. Duch, A., Canal, B., Barroso, S. I., García-Rubio, M., Seisenbacher, G., Aguilera, A., … & Posas, F. (2018). Multiple signaling kinases target Mrc1 to prevent genomic instability triggered by transcription-replication conflicts. Nature communications, 9(1), 379. https://doi.org/10.1038/s41467-017-02756-x

撰文｜蕭皓文
審稿｜張智婷