巨噬細胞（macrophage）在發炎反應中扮演很重要的角色，除了參與前期發炎反應的活化，又需要在後期參與發炎反應的解除（resolution），使細胞回復正常狀態。當這兩個功能失去平衡時，組織內就會發生慢性發炎，進而引起其他健康問題。當發炎反應發生時，免疫細胞中的脂肪代謝會發生改變。先前的研究指出，發炎反應發生後的 12 至 24 小時會有脂肪酸生成並參與發炎反應的解除 [1]。而本文則是要探討長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，以下簡稱 lncRNA）如何調控脂肪酸的代謝，並影響巨噬細胞解除發炎反應的分子機制。
研究團隊收集經脂多醣（lipopolysaccharide，以下簡稱 LPS）刺激後 24 小時的骨髓源性巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）做 mRNA 定序，試圖分析哪些 lncRNA 參與巨噬細胞於後期解除發炎反應的過程。研究團隊從一千多條 lncRNA 中挑出在發炎反應後期（24 小時和 48 小時）還持續表現的 11 個候選 lncRNA。經比對和基因抑制 (siRNA silencing) 實驗證實，其中被選中的 lncFAO（fatty acid β-oxidation）有參與巨噬細胞於後期解除發炎反應的過程；在不同時間點下抑制 lncFAO 表現後也發現，發炎反應因子 Il1b 和 S100a8 的 mRNA 表現量和 WT 相比有提高（圖一 A）。另外，經 LPS 刺激後， lncFAO 在前期（約 12 小時內）的表現量比較低，但在後期（24 和 48 小時）會升高 （圖一 B）。為了更進一步了解 lncFAO 對個體生理功能的影響，研究團隊利用 CRISPR-Cas9 技術建立 lncFAO 剔除小鼠（knockout），小鼠實驗也呼應了細胞實驗的結果。lncFAO−/− 老鼠經 LPS 刺激後和控制組相比存活率下降（圖一 C），血液中的發炎反應因子 Il1-a 和 IL-6 也較高（圖一 D）。小鼠的傷口癒合實驗也發現，lncFAO−/−老鼠的傷口不易癒合（圖一 E），Ly6Chi 巨噬細胞浸潤傷口的程度高（圖一 F）。這樣的結果指出，lncFAO 對抑制 LPS 所引起的發炎反應是重要的。
圖一，抑制 lncFAO 的表現，會促進發炎反應。（A）發炎反應因子 Il1b 和 S100a8 在巨噬細胞中的 mRNA 表現量。（B）經 LPS 誘發發炎反應後，lncFAO 表現量在 24 小時達到高峰。（C）經 LPS 誘發發炎反應後的小鼠存活曲線圖。（D）小鼠血中發炎反應因子 Il1a 和 IL-6 蛋白質含量。（E）小鼠傷口面積圖。（F）Ly6Chi 巨噬細胞浸潤定量圖。圖片來源：https://doi.org/10.1073/pnas.2005924117
lncRNA 通常表現於細胞核中並調控基因的轉錄，但經 LPS 刺激後的 lncFAO 卻大量表現在細胞質中，因此研究團隊認為 lncFAO 在細胞質中可能和其他蛋白質產生交互作用，進而影響巨噬細胞緩解發炎反應的作用。為了驗證這個假說，研究團隊利用生物素（biotin）標定的 lncFAO 將可能和 lncFAO 產生交互作用的蛋白質純化，並用質譜儀（mass spectrometry）分析，鑑定出候選蛋白 HADHB，後續的實驗也證明 lncFAO 會和位在粒線體中的 HADHB 蛋白結合（圖二 B-D）。粒線體三功能蛋白（mitochondrial trifunctional protein） 位於粒線體內膜上，負責調控脂肪酸氧化（fatty acid β-oxidation）最後三個步驟，同時具有 hydroxyacyl-CoA dehydrogenase、3-ketoacyl-CoA thiolase、enoyl-CoA hydratase 三種活性（圖二 A），而 HADHB 為其中的 β 次單元 [2]。lncFAO−/−小鼠和基因正常型小鼠在沒有給予 LPS 的情況下，HADHB 的蛋白質和 mRNA 含量並無差異。在 LPS 的刺激下，基因正常型小鼠 HADHB 的 mRNA 和蛋白質含量都會下降（圖二 E），但在 lncFAO−/− 小鼠組別中，雖然 HADHB 的蛋白質含量和正常組相比是下降的，但是 mRNA 含量卻沒有下降（圖二 E-F），表示 LPS 對 HADHB 蛋白質含量的影響會受 lncFAO 調控，這樣的機制屬於轉錄後調控（post-transcriptional regulation）。
圖二，lncFAO 和 HADHB 結合後並活化其酵素能力。（A）脂肪酸氧化代謝途徑示意圖。（B-C）巨噬細胞經 LPS 處理 24 小時後，用鏈黴親合素（streptavidin）微珠將生物素標定的 lncFAO 及其結合的蛋白質複合體純化後，經西方墨點法（Western blot）所呈現的蛋白質膠圖。（D）巨噬細胞經 LPS 處理 24 小時後，lncFAO 在不同胞器間的分布。（E-F）HADHB 經西方墨點法所呈現的蛋白質膠圖及其定量圖。圖片來源：https://doi.org/10.1073/pnas.2005924117
HADHB 具有硫解酶（thiolase）的活性，可以催化脂肪酸氧化的最後三個步骤，中間產物會生成比原始產物少兩個碳原子並加上乙醯輔酶 A（acetyl-CoA）的脂肪酸，終產物則是帶有醯基輔酶 Ａ 的脂肪酸（圖二 A）。藉由測量細胞萃取液中的脂肪醯輔酶 A（fatty acyl CoA）含量是否可轉化成乙醯輔酶 A，即可了解 lncFAO 是否會影響 HADHB 的硫解酶活性。結果顯示，lncFAO−/− 巨噬細胞的 HADHB 活性比正常組下降。然而將外源 lncFAO 轉染（transfect） lncFAO−/− 巨噬細胞組別則發現 HADHB 活性會回升，表示 lncFAO 和 HADHB 的結合可以影響 HADHB 蛋白的活性。研究團隊進一部探討剔除 lncFAO 是否會影響粒線體的功能，結果顯示，lncFAO−/− 巨噬細胞組別的基礎耗氧速率（basal oxygen consumption rate，OCR）比正常組別低，表示缺乏 lncFAO 會影響粒線體中的脂肪酸氧化的能力（圖三 B-E）。接下來，研究團隊想要知道 HADHB 蛋白的功能缺失是否是造成 lncFAO−/− 巨噬細胞組別發炎反應的主因，因此在巨噬細胞中利用 siRNA 分別抑制 Hadhb 基因和 lncFAO 的表現。結果發現，經 LPS 刺激後，巨噬細胞中 Il1a 和 Il6 的 mRNA 表現量皆比未刺激的組別高，而同時抑制 Hadhb 和 lncFAO 後，Il1a 和 Il6 的表現量卻沒有比單獨抑制 Hadhb 基因更多（圖三 F-G），這個結果除了支持 HADHB 蛋白在 lncFAO−/− 巨噬細胞中調控發炎反應的重要性之外，也說明 Hadhb 和 lncFAO 是在同一條路徑上影響著發炎反應。
圖三，lncFAO 調控粒線體的脂肪酸代謝途徑。（A）lncFAO 影響 HADHB 蛋白硫解酶活性。（B-E）lncFAO會影響粒線體的功能及其脂肪酸代謝途徑。（F-G）lncFAO 和 HADHB 共同調控發炎反應因子的表現。圖片來源：https://doi.org/10.1073/pnas.2005924117
綜合上述研究結果，此研究發現，經 LPS 刺激後的巨噬細胞，其 lncFAO 在粒線體的表現量會上升並且活化 HADHB 蛋白，而 lncFAO 的缺失則會影響 HADHB 蛋白的活性，進而影響粒線體的脂肪酸代謝途徑，使巨噬細胞發炎反應因子持續表現而無法緩解，但目前還不清楚 lncFAO 如何活化 HADHB 蛋白。
Main Article:
Nakayama, Y., Fujiu, K., Yuki, R., Oishi, Y., Morioka, M. S., Isagawa, T., Matsuda, J., Oshima, T., Matsubara, T., Sugita, J., Kudo, F., Kaneda, A., Endo, Y., Nakayama, T., Nagai, R., Komuro, I., & Manabe, I. (2020). A long noncoding RNA regulates inflammation resolution by mouse macrophages through fatty acid oxidation activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 117(25), 14365–14375. https://doi.org/10.1073/pnas.2005924117
參考文獻：
[1] Oishi, Y., Spann, N. J., Link, V. M., Muse, E. D., Strid, T., Edillor, C., Kolar, M. J., Matsuzaka, T., Hayakawa, S., Tao, J., Kaikkonen, M. U., Carlin, A. F., Lam, M. T., Manabe, I., Shimano, H., Saghatelian, A., & Glass, C. K. (2017). SREBP1 Contributes to Resolution of Pro-inflammatory TLR4 Signaling by Reprogramming Fatty Acid Metabolism. Cell metabolism, 25(2), 412–427. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2016.11.009
[2] Xia, C., Fu, Z., Battaile, K. P., & Kim, J. P. (2019). Crystal structure of human mitochondrial trifunctional protein, a fatty acid β-oxidation metabolon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 116(13), 6069–6074. https://doi.org/10.1073/pnas.1816317116
延伸閱讀 ｜從垃圾 DNA 中掏出黃金：lncRNA 與演化
撰文｜蔡伊婷
審稿｜陳柔含
