信使 RNA（Messenger RNA, mRNA）是 DNA 轉錄轉譯合成蛋白質的重要橋樑。儘管蛋白質常被認為是主要執行生物活性的物質，然而隨著RNA相關研究的進展，近年來 mRNA 的臨床應用也逐漸受到重視。相較於直接使用蛋白質製劑，mRNA 的優點在於省去了蛋白質合成和純化繁複的步驟，因此可以快速生產，並且更能即時因應臨床需求而修改。在新冠疫情爆發之初，最先研發出來的也是BNT和莫德納 mRNA 疫苗，後續更在短短數月內研發出對抗新型變異株的次世代疫苗。因此，mRNA 製劑相當具有發展潛力，除了疫苗之外，還有癌症治療、遺傳疾病、再生療法、免疫療法等等用途 [1]。
mRNA 療法的兩大組成部分包括：編碼目標蛋白質的基因序列，以及將 mRNA 送入細胞的載體。大多數載體使用脂質奈米粒子（Lipid nanoparticles, LNP）來包裹 mRNA，透過受體媒介（receptor-mediated）進入細胞，將 mRNA 送至細胞質進行目標蛋白質的轉譯 [2]。然而，在這個傳遞 mRNA 的過程中，最大的挑戰是要避免體內的免疫反應。特別是先天免疫系統能夠偵測雙股 RNA，並啟動免疫攻擊破壞，因而降低了 mRNA 療法的效果。
在製作 mRNA 的過程，通常是在體外（in vitro）由 DNA 模板轉錄製成，其中 T7 RNA 聚合酶polymerase）因為能夠對帶有化學修飾的三磷酸核苷酸 (nucleotide triphosphates, NTP)進行聚合反應，因此常被用於將 DNA 模板轉錄成 RNA，。然而 T7 RNA 聚合酶在推動轉譯作用的同時，卻也會製造雙股 RNA ，因而引起先天免疫系統的攻擊 [3]。因此，要如何維持尿嘧啶的修飾，又同時減少雙股 RNA 的產生，成為研發 mRNA 療法的一大課題。
作者Jennifer Nelson 等人為了想要最佳化 mRNA 療法的效果，以人類促紅血球生成素 （human erythropoietin, hEPO）作為範例，分別比較利用了尿嘧啶（U）或是 N1-methylpseudo-uridine-5′-triphosphate（1mΨ）合成之 mRNA，並且比較是否透過額外步驟純化去除雙股 RNA，何者具有較高轉譯效果，並且能作為降低免疫反應的 mRNA 製劑。
研究團隊將製程分為兩種，稱為 A 和 B，這兩種製程的差別在於核苷酸的比例和去除雙股 RNA 的方式。在A 製程中，核苷酸 AUCG 以相同莫耳數加入，而 B 製程則是依照模板的比例加入核苷酸，以避免多餘的核苷酸導致雙股 RNA 產生。此外，A 製程只利用一般的樹脂（2′-deoxy-T20 oligo resin） 純化，而 B 製程再加上反相高效能液相層析法（reversed-phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC） 進一步移除雙股 RNA。 A 和 B 兩種 mRNA 製程，又可分別配合兩種 mRNA 修飾 : 尿嘧啶（U）或是 N1-methylpseudo-uridine-5′-triphosphate（1mΨ） ，總共組合出四種 mRNA 產物：A（U）A（1mΨ）B（U）和 B（1mΨ）。
圖一、研究中依據核苷酸修飾與純化方式組合出的四種 mRNA 產物
結果發現，製程 A 無論以 U 或是 1mΨ 修飾，都會產生較多的雙股 RNA，並且在細胞內的蛋白質產物也較少。另外，製程 A 的mRNA 也會誘導干擾素 β（interferon-β, IFNβ）的分泌，代表細胞啟動先天免疫攻擊 mRNA，因此干擾素β的分泌量越多，蛋白質產物就越少。而在這四種製程中，A（U）明顯造成最多的干擾素β 分泌。團隊也利用酵素連結免疫吸附劑分析法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）定量雙股 RNA，發現雙股 RNA 與 IFNβ 的分泌量成正比，也證實了雙股 RNA 正是刺激 IFNβ 分泌的主因。
為了進一步了解雙股 RNA 是如何活化 IFN 的分泌，研究團隊在單核球（monocyte） IFN 基因啟動子（promoter） 的下游加入螢光蛋白信號（Lucia luciferase gene reporter）。一旦 IFN 啟動子活化時，便會同時產生螢光蛋白，藉此偵測 IFN 的分泌。 其中類鐸受體（Toll-like receptors , TLR） 和 維生素A酸誘導基因-I（retinoic acid–inducible gene I, RIG-I） 是先天免疫活化的重要路徑 [4]，，研究中也發現，當在細胞內加入刺激 IFN, TLR 和 RIG-I 的因子，都可以活化 IFN 基因啟動子。
圖二、研究中推論單股及雙股RNA各自的訊號傳遞途徑
當雙股 RNA 進入細胞，將會活化 RIG-I 和 MDA5，此訊號會經由 MAVS 傳到 IFN 轉錄調節因子（transcription factors IFN regulatory factor, IRF）3, 7 和 NF-κB，而啟動 IFN 的基因表現 [4]。研究團隊利用 CRISPR-Cas9 製造出 MAVS 基因剔除的細胞，使得 RIG-I 和 MDA5 偵測到雙股 RNA 的信號無法往下傳遞，因而減少 IFN 的生成。
一般來說，TLR7/8 主要偵測單股RNA，並透過訊號傳導因子MyD88，活化下游 IFN 基因表現 [5]。然而，令人意外的是，在雙股 RNA 訊號傳導因子 MAVS 基因剔除的細胞中，TLR7/8 路徑也因此無法活化。研究團隊推測可能是 IFN 的減少也會導致TLR7/8 路徑無法活化，因此進一步設計了TLR7/8的訊號傳導因子 MyD88 剔除細胞。理論上，MyD88的剔除只會影響單股 RNA-TLR7/8 的路徑，而雙股 RNA 仍然活化 MAVS 導致 IFN 的分泌。
將上述四種製程 A（U）A（1mΨ）B（U）和 B（1mΨ）的 mRNA 分別加入 MAVS 和 MyD88 基因剔除的細胞，發現在MAVS基因剔除的細胞都幾乎無法產生 IFN，但在 MyD88 基因剔除的細胞中，A（U）仍然可以透過雙股 RNA 刺激 IFN 分泌。以上實驗證實了細胞主要透過雙股 RNA-RIG-I/MDA5-MAVS 的路徑來活化 IFN 的分泌。此外，團隊將 mRNA 加入 RIG-I 和TLR7/8 剔除的細胞後，發現 IFN 的分泌完全被抑制，證實了 RIG-I 是細胞主要偵測雙股 RNA 的受體。最後，團隊發現若 mRNA 也會引起免疫趨化因子 CXCL10（C-X-C motif chemokine 10, CXCL10, aka IFNγ-induced protein 10）分泌。其中製程 A 和 經由 U 修飾的 mRNA 引起較多 CXCL10 的分泌，表示雙股 RNA 和 尿嘧啶較容易引起先天免疫的活化。
除了細胞實驗，研究團隊也將 hEPO mRNA 注入老鼠，發現製程 B 相較於製程 A 在老鼠體內產生更多的蛋白質。另外，製程 A 也刺激了更大量的 IFN 分泌，尤其是在 U 修飾的mRNA中更為顯著。這個動物實驗也驗證了先前的細胞實驗，雙股 RNA 和 Ｕ修飾會減少 mRNA 轉譯成蛋白質的效率，並且容易促進宿主的免疫反應。此外，研究團隊使用流式細胞儀（flow cytometry）來進一步分析，宿主免疫細胞活化的情形，發現除了 B（1mΨ）以外， A（U）B（U）A（1mΨ）都會促進 B 細胞活化。驗證先前細胞實驗中，CXCL10 容易受到雙股 RNA 和尿嘧啶的刺激，而單股 RNA 也會透過 TLR7/8 路徑活化免疫反應。
最後，研究團隊想要了解 1mΨ 和 U 對於 雙股 RNA 活化 RIG-I/MDA5-MAVS 的影響。當在 MAVS 剔除和對照組小鼠加入 RIG-I 促進劑 5′ppp-hpRNA 時，由於缺乏 MAVS 傳導 RIG-I 的信號，因此下游無法分泌 IFNα。而將 A（U） 加入 MAVS 剔除的小鼠後，發現 IFNα 的分泌確實達到顯著的下降，同時影響到其他先天免疫的細胞激素 CCL4 和 CCL5 分泌，導致全身性的發炎反應減少。此外，研究團隊同樣使用流式細胞儀，進一步證實 B 細胞的活化也需要 IFNα 的刺激，缺乏 MAVS 的小鼠雖然整體B 細胞數量並未改變，卻不能轉換為免疫活化狀態。
這篇研究揭開了 mRNA 在生物體內可能影響免疫系統的機轉，透過減少雙股 RNA 的生成，以及改善 mRNA 的 U 修飾技術，可以避免免疫攻擊，同時提升蛋白質表現量，對於日後發展 mRNA 生物製劑用於治療和疾病預防上，具有相當重要的貢獻。
Main Article: Nelson, J., Sorensen, E. W., Mintri, S., Rabideau, A. E., Zheng, W., Besin, G., … & Joyal, J. L. (2020). Impact of mRNA chemistry and manufacturing process on innate immune activation. Science advances, 6(26), eaaz6893.
參考文獻：
[1] Wang, Z., Ma, W., Fu, X., Qi, Y., Zhao, Y., & Zhang, S. (2023). Development and applications of mRNA treatment based on lipid nanoparticles. Biotechnology Advances, 108130.
[2] Patel, S., Ashwanikumar, N., Robinson, E., DuRoss, A., Sun, C., Murphy-Benenato, K. E., … & Sahay, G. (2017). Boosting intracellular delivery of lipid nanoparticle-encapsulated mRNA. Nano letters, 17(9), 5711-5718.
[3] Kormann, M. S., Hasenpusch, G., Aneja, M. K., Nica, G., Flemmer, A. W., Herber-Jonat, S., … & Rudolph, C. (2011). Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature biotechnology, 29(2), 154-157.
[4] Rehwinkel, J., & Gack, M. U. (2020). RIG-I-like receptors: their regulation and roles in RNA sensing. Nature Reviews Immunology, 20(9), 537-551.
[5] Heil, F., Hemmi, H., Hochrein, H., Ampenberger, F., Kirschning, C., Akira, S., … & Bauer, S. (2004). Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science, 303(5663), 1526-1529.
[5] 2022年第五屆唐獎系列報導 – HPLC 純化的 mRNA 可降低免疫原性
[6] 2022 唐獎生技醫藥獎──mRNA 疫苗發展的學理基礎
關鍵字：NEWS、2023諾貝爾獎小新聞、mRNA、疫苗
撰文｜高佳煜
審稿｜葉國掄
