細菌療法的概念源自 19 世紀末威廉．柯立 （William Coley）大膽使用細菌治療癌症的嘗試，雖然當時因為不清楚治療機制、也未經過嚴謹的驗證而被視為「蒙古大夫的偏方」[1]。然而隨著近年對免疫治療的理解以及合成生物學技術的進步，細菌療法因為在對抗癌症上具有（1）能在腫瘤中選擇性的定殖、（2）誘導免疫系統活化、（3）容易改造等優勢又再次獲得關注。
在眾多免疫調節的細胞激素中，腫瘤壞死因子 α（Tumor Necrosis Factor Alpha, TNF-α）最初因為在高濃度下能誘導腫瘤壞死的特性而得名，然而最近的研究也顯示在腫瘤微環境中的 TNF-α 中度表現可能具有促腫瘤信號的功能，也因此限制了阻斷式抗體的療效[2]。已故中研院副研究員牟昀博士的團隊提出了一種「特洛伊木馬」策略，不直接阻斷作用複雜的 TNF-α，而是將其作為將毒素傳遞到癌細胞內部的標靶，設計了非中和性 TNF-α 抗體在與 TNF-α 及其受體結合後，共同進入細胞內（圖一）。
圖一、使用大腸桿菌遞送抗體藥物複合體的示意圖
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2022.04.008
首先，為了找出結合力夠強的 TNF-α 抗體，研究團隊分別使用了噬菌體顯示法（Phage display）（圖二）[3]，以及酵母表現顯示法（Yeast Surface Display）後，得到一群高特異性的 TNF-α 抗體，並且這些抗體不影響 TNF-α 與其受體 TNFR1 的結合，也不影響 TNF-α 誘導特性細胞走向凋亡的功能。
圖二：噬菌體顯示法運作原理：使用高突變機率的噬菌體，快速產生大量變異的抗體，並以藥物標的持續篩選結合力更強的抗體。
圖片來源：https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2018/popular-information/
接著，為了證明挑選出的 TNF-α 抗體 Pigbak#2 能順利被吞入細胞內，團隊也分別以流式細胞儀與免疫螢光染色進行驗證，使用兩種小鼠癌細胞系 B16F10 和 4T1，在 37°C 下兩者都能迅速將 TNF-α 吞入細胞內，並形成點狀結構（圖三），而若是降溫至 4°C 強制停止所有胞吞作用後 [4]，TNF-α 便會停留在細胞外。
圖三：使用免疫螢光染色驗證 TNF-α 抗體可被吞入細胞內，圖右同時加入 TNF-α 以及 Pigbak#2 抗體後，可觀察到兩者分布重疊，並且皆位於細胞內。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2022.04.008
再來為了證明這些 TNF-α 抗體可以順利攜帶藥物，並且具有可控的毒性，團隊也分別將抗體藥物複合體常用的毒素 Mertansine（DM1）以及假單胞菌的外毒素（Pseudomonas exotoxin）PE38 接上抗體 [5]，如同預期的，單獨的 TNF-α 或是 TNF-α 抗體藥物複合體都不具有細胞毒性，只有在兩者同時存在時，抗體藥物複合體才能透過 TNF-α 的胞吞進入細胞內，呈現強烈的細胞毒性（圖四），達到類似合成生物學中 AND Gate 的效果（註一）。
圖四：TNF-α 抗體藥物複合體只有在 TNF-α 存在時具有明顯細胞毒性。
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最後為了驗證整個「大腸桿菌遞送抗體藥物複合體」想法的可行性，團隊也在小鼠腫瘤模型中進行實驗，當小鼠體內腫瘤長至 100-200 mm3 後，團隊對小鼠進行磷酸鹽緩衝液、單純的大腸桿菌、以及能生產抗體藥物複合體 Pigbak#2-PE38 的大腸桿菌的單次注射，結果只有注射 Pigbak#2-PE38 大腸桿菌顯著抑制黑色素瘤的生長，甚至在治療 10 天後仍維持 100% 的存活率，相比之下注射磷酸鹽緩衝液或大腸桿菌的小鼠腫瘤大多迅速擴大到超過 2000 mm3，且多數死亡（圖五）。進一步對腫瘤中的免疫細胞組成進行分析後也發現，Pigbak#2-PE38 細菌治療能引起具有抗癌能力的中性球 N1 極化增加、巨噬細胞 M1 極化增加、以及活化的 CD4+ 和 CD8+ 細胞的增加，活化適合對抗癌細胞的免疫細胞，最終反應的總和成功逆轉了免疫抑制。
圖五：Pigbak#2-PE38 大腸桿菌能顯著抑制黑色素瘤的生長（圖左）並提升存活率（圖右）。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2022.04.008
這種巧妙的細菌療法將一個可能促使癌症發展的關鍵蛋白變成了讓癌細胞自我毀滅的手段。模組化的設計也可以應用於各種不同的抗體-藥物載體組合，應用於更多不同類型的癌細胞，為癌症治療帶來新的可能性。
註一：在合成生物學中，AND gate（及閘）只在多個輸入同時存在時才產生輸出（如文中的 TNF-α 及 TNF-α 抗體藥物複合體），若只出現其中一個訊號則不會啟動後續的訊號傳遞，這種設計能夠提高對特定刺激的精確控制，減少訊號泄漏造成的影響。
Main Article:
Hu, C. W., Chang, Y. C., Liu, C. H., Yu, Y. A., & Mou, K. Y. (2022). Development of a TNF-α-mediated Trojan Horse for bacteria-based cancer therapy. Molecular Therapy, 30(7), 2522-2536. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2022.04.008
參考文獻：
1. 泛科學文章：太瘋狂了！注射細菌，竟然能夠「以毒攻毒」打敗癌細胞？細菌療法的前世（上）
2. Montfort, A., Colacios, C., Levade, T., Andrieu-Abadie, N., Meyer, N., & Ségui, B. (2019). The TNF Paradox in Cancer Progression and Immunotherapy. Frontiers in immunology, 10, 1818. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.01818
3. CASE 報科學：【2018年諾貝爾化學獎】化學的(革命性)進化
4. Weigel, P. H., & Oka, J. A. (1981). Temperature dependence of endocytosis mediated by the asialoglycoprotein receptor in isolated rat hepatocytes. Evidence for two potentially rate-limiting steps. The Journal of biological chemistry, 256(6), 2615–2617. https://doi.org/10.1016/S0021-9258(19)69656-0
5. Fu, Z., Li, S., Han, S., Shi, C., & Zhang, Y. (2022). Antibody drug conjugate: the “biological missile” for targeted cancer therapy. Signal transduction and targeted therapy, 7(1), 93. https://doi.org/10.1038/s41392-022-00947-7
撰文｜葉國掄
審稿｜蕭皓文
