螢光蛋白（Fluorescent protein）和螢光素酶（Luciferase）都是在生物影像中被廣泛應用的工具（圖一）。螢光蛋白通常較容易使用（僅需加入或表現螢光蛋白，並使用對應波長激發）但具有容易受樣本中自體螢光（Autofluorescence）影響以及長期曝光下可能出現光褪色（Photobleach）等缺點。相較之下，螢光素酶（Luciferase）通過化學反應產生螢光，具有較高的信號雜訊比（Signal-to-noise ratio），特別適合用於更靈敏的檢測與實時觀測以及需要更強光源的深層組織影像。
圖一、螢光和生物發光的示意圖
圖片來源：https://doi.org/10.1007/s12015-014-9575-3
然而螢光素酶的發展上卻有許多限制，目前已被發現的天然螢光素酶很少、部分需要多個雙硫鍵的結構不易正確摺疊、多數天然螢光素酶無法使用光物理特質更理想的合成螢光素、難以不互相干擾的使用多種螢光素酶等，也因此有許多研究嘗試製造新的螢光素酶。過去的做法主要從蛋白質資料庫（註一）當中收錄的天然螢光素酶進行改造，但這種作法不容易找到能結合合成螢光素的結構，並且序列修改後的蛋白結構也不易預測。
註一：蛋白質資料庫（Protein Data Bank, PDB）是一個收集和分享生物大分子（如蛋白質和核酸）結構資訊的國際資料庫，提供免費、容易取得的結構資料，協助生物大分子結構和功能的研究。
在這篇研究當中，作者首先選定了具有高量子效率（quantum yield）、紅移的發射光譜、良好的體內藥動學特性、且不須額外輔酶的合成螢光素 DTZ（diphenylterazine）作為基礎，再開始設計蛋白。他們先是從4000個天然小分子的結合蛋白中找出適合 DTZ 形狀的 NTF2（Nuclear transport factor 2），接著使用深度網絡幻覺[1]，先是透過 RifGen 生成和 DTZ 能產生交互作用的胺基酸側鏈，再使用 RifDock 將這些構造與蛋白支架結合，並對前 50000 個結構使用 RosettaDesign 進行序列的優化[2] （圖二），最後設計出7648個結構進行後續篩選。
圖二、（A）使用馬可夫鏈蒙特卡羅（MCMC）抽樣分別優化活性位點與蛋白骨架的序列（B）生成螢光素酶受質DTZ的可能立體構形（C）創建DTZ的旋轉異構體互動場（Rotamer Interaction Field, RIF）排列出可交互作用的胺基酸（D）將RIF對接到可能的蛋白質骨架中，並優化結構。
圖片來源：doi: 10.1038/s41586-023-05696-3.
研究團隊將設計出的序列以質體表現於大腸桿菌中，接著透過菌落篩選的方式找出最有效的螢光素酶，取名為 LuxSit。這個螢光素酶由117個胺基酸組成是，是當時所知最小的螢光素酶，除此之外，在大腸桿菌中的表現量高、溶解性佳、高溫下仍保持穩定等特性，加入 DTZ 後測得的發光峰值也與預期的 480 奈米一致（圖三）。
圖三、（A）使用 SDS-PAGE 粗略估計 LuxSit 的大小（B）粒徑篩析層析法顯示 LuxSit 的單體性質（C）遠紫外圓二色光譜中 LuxSit 在加熱後能維持 220nm 處的均殘基橢圓性（mean residue ellipticity, MRE）表示有熱穩定的特性（D）測量 LuxSit 的發射光譜。
圖片來源：doi: 10.1038/s41586-023-05696-3.
最後，由於 LuxSit 和先前發現或設計的螢光素酶相比有著明顯更高的選擇性，也因此讓同時使用多種螢光素酶成為可能。為了證實這個想法，研究團隊將序列優化後的 LuxSit-I 與 RLuc一起表現在同一細胞中，分別做為 NF-κB 和 cAMP 信號途徑的報導基因，並使用不同的螢光素基底來產生螢光，也確實看到只有在添加正確的誘導物和螢光素組合時才會發光，展示了同時使用多種螢光素酶進行細胞生物學研究的可行性（圖四）。
圖四、（A）共表現 LuxSit-I 與 RLuc 做為報導基因的實驗示意圖（B）（C）只有在加入正確組合的誘導物和螢光素（FSK+PPCTZ/TNF+DTZ）時才會產生對應螢光。
圖片來源：doi: 10.1038/s41586-023-05696-3.
這篇研究不僅開拓了螢光素酶在生物影像上的應用，更展示了結合深度學習技術與蛋白質工程的潛力，透過適當的模擬與篩選，將可能創造出前所未見的蛋白，大幅擴展在藥物發現、疾病診斷和細胞治療等多個生物醫學領域中能使用的工具。
Main Article:
Yeh, A. H., Norn, C., Kipnis, Y., Tischer, D., Pellock, S. J., Evans, D., Ma, P., Lee, G. R., Zhang, J. Z., Anishchenko, I., Coventry, B., Cao, L., Dauparas, J., Halabiya, S., DeWitt, M., Carter, L., Houk, K. N., & Baker, D. (2023). De novo design of luciferases using deep learning. Nature, 614(7949), 774–780. https://doi.org/10.1038/s41586-023-05696-3
參考文獻：
- Anishchenko, I., Pellock, S. J., Chidyausiku, T. M., Ramelot, T. A., Ovchinnikov, S., Hao, J., Bafna, K., Norn, C., Kang, A., Bera, A. K., DiMaio, F., Carter, L., Chow, C. M., Montelione, G. T., & Baker, D. (2021). De novo protein design by deep network hallucination. Nature, 600(7889), 547–552. https://doi.org/10.1038/s41586-021-04184-w
- Norn, C., Wicky, B. I. M., Juergens, D., Liu, S., Kim, D., Tischer, D., Koepnick, B., Anishchenko, I., Foldit Players, Baker, D., & Ovchinnikov, S. (2021). Protein sequence design by conformational landscape optimization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 118(11), e2017228118. https://doi.org/10.1073/pnas.2017228118
